去势模型建立与表型验证
验证雄激素缺乏是否诱导睑板腺功能障碍和眼表损伤。
对6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠行双侧睾丸切除，设假手术对照；检测血清睾酮、睑板腺面积、角膜荧光素染色及脂质合成标志物免疫荧光。
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单细胞测序揭示雄激素缺乏阻滞睑板腺细胞分化并损害EMC介导的脂质代谢
Single-Cell Sequencing Reveals Androgen Deficiency Arrests Meibocyte Differentiation and Impairs EMC-Mediated Lipid Metabolism
实验完整度
高包含去势小鼠模型、局部DHT干预、scRNA-seq、免疫荧光、角膜荧光素染色等多个独立证据层级，并有功能与机制分析。
主要模型
C57BL/6J小鼠去势MGD模型 局部0.08% DHT治疗的去势小鼠 睑板腺Krt14⁺上皮细胞scRNA-seq
重点核对
去势手术：6-8周龄雄性C57BL/6J小鼠双侧睾丸切除，假手术对照 DHT处理：0.08% DHT混悬液，每眼2 µL，每日三次，持续2、4或6周 scRNA-seq样本：每组3个生物学重复，每个重复混合2只小鼠睑板腺，目标捕获约8000细胞 血清睾酮检测：去势后1周和3周及治疗结束时用ELISA试剂盒（E-OSEL-Mo003）测定 角膜荧光素染色评分：5个区域各0-4分，总分0-20，于去势后1、3、6周及DHT治疗2、4、6周评估
摘要
目的：探究雄激素缺乏性睑板腺功能障碍（MGD）的细胞动力学，并阐明限制局部双氢睾酮（DHT）治疗结构再生疗效的分子机制。方法：对假手术对照组、去势小鼠及接受局部0.08% DHT治疗的去势小鼠的睑板腺进行单细胞RNA测序（scRNA-seq）。我们进行了比较分析，以量化细胞组成的变化，重建分化轨迹，并系统分析代谢途径和细胞器稳态网络的变化。结果：去势阻滞了睑板腺细胞分化并重定向了细胞命运决定。伪时间轨迹分析显示，睑板腺细胞谱系向导管和祖细胞命运发生了显著偏移，并伴随脂肪生成基因（如Fasn、Awat2）的全面下调。这种命运重编程与内质网（ER）稳态的破坏相耦合，包括内质网膜蛋白复合物（EMC）的抑制和脂质组装机制的受损。局部DHT治疗部分恢复了睑板腺细胞分化，但未能完全恢复腺体形态。此外，DHT治疗后快速的代谢再激活超过了ER能力的恢复，诱导了蛋白质稳态应激。结论：雄激素缺乏通过双重机制驱动MGD：将睑板腺细胞命运重编程为非脂肪生成谱系，以及抑制EMC介导的ER驻留脂肪生成酶的稳定化。DHT治疗时脂肪生成再激活与ER能力恢复之间的时间错配导致蛋白质稳态应激，限制了雄激素单药治疗的疗效，并将EMC–ER轴确定为组合干预的候选治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 雄激素缺乏如何通过细胞命运和代谢途径改变导致睑板腺功能障碍，以及局部DHT治疗为何不能完全恢复腺体结构和功能。
- 核心机制
- 雄激素缺乏通过双重机制驱动MGD：将睑板腺细胞命运重编程为导管和祖细胞样状态，并抑制EMC介导的内质网驻留脂肪生成酶稳定化；DHT治疗时脂肪生成快速再激活与ER能力恢复不匹配，诱导蛋白质稳态应激。
- 主要证据
- scRNA-seq显示去势小鼠分化睑板腺细胞几乎消失、脂肪生成基因（Fasn、Awat2等）下调、EMC亚基（如Emc9）下调及ER容量评分降低；局部DHT部分恢复细胞组成和脂肪生成基因表达，但ER容量恢复不完全且终末UPR基因（Ddit3、Hspa1a）上调。
- 研究意义
- 首次将scRNA-seq应用于经典去势诱导MGD模型，提供雄激素依赖性睑板腺重塑的单细胞分辨率图谱，并将EMC–ER轴确定为MGD组合干预的候选治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
局部DHT治疗及疗效评估
评估局部DHT补充能否逆转去势诱导的MGD表型。
去势后6周开始局部给予0.08% DHT混悬液或0.1% DMSO/PBS溶剂，每日三次，持续2、4或6周；检测血清睾酮、角膜荧光素染色、睑板腺面积及脂质标志物。
单细胞转录组测序与细胞组成分析
解析去势及DHT治疗对睑板腺细胞组成和转录程序的影响。
采集NC、CAS和DHT组睑板腺制备单细胞悬液，构建10x Genomics文库并测序；质控后对Krt14⁺上皮细胞进行聚类、注释和差异表达分析。
伪时间轨迹与细胞命运分析
重建睑板腺细胞分化轨迹并量化去势对细胞命运决定的影响。
使用Monocle 2重建分化轨迹，比较NC、CAS和DHT组沿轨迹的细胞分布和状态比例，并对状态间差异基因进行聚类。
ER容量与蛋白质稳态分析
量化雄激素缺乏及DHT治疗对ER功能和UPR的影响。
计算ER容量评分（379个折叠/结构相关基因，如Emc1–Emc10）和终末UPR评分（63个凋亡相关基因，如Ddit3），并进行基因-基因相互作用网络和Spearman相关分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 血清睾酮检测 | 小鼠睾酮酶联免疫吸附测定试剂盒 | Elabscience | E-OSEL-Mo003 |
| DHT处理 | 双氢睾酮粉末 | Aladdin | D413176 |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | V900090 | |
| 角膜荧光素染色 | 荧光素钠溶液 | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | 抗PPARγ抗体（克隆C26H12） | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗脱氧核糖核酸酶2抗体 | Proteintech | 15934-1-AP | |
| 抗AWAT2抗体 | Affinity Biosciences | DF9149 | |
| 抗PLIN2抗体 | Proteintech | 15294-1-AP | |
| Invitrogen Alexa Fluor 594二抗 | Thermo Fisher Scientific | A32754 | |
| Invitrogen Alexa Fluor 488二抗 | Thermo Fisher Scientific | A21206 | |
| Invitrogen抗荧光淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36931 | |
| 单细胞悬液制备 | 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | -- |
| 单细胞文库构建 | Chromium Next GEM单细胞3′试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| 组织包埋 | 最佳切割温度包埋剂 | Sakura Finetek USA | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 去势模型建立 | 小鼠品系、周龄、性别、去势手术方式、假手术对照设置、血清睾酮检测时间点 阅读提示：Methods中Animals和Castration Surgery and DHT Treatment小节 |
| 局部DHT治疗 | DHT浓度、溶剂组成、每眼给药体积、每日给药次数、治疗持续时间 阅读提示：Methods中Castration Surgery and DHT Treatment小节 |
| scRNA-seq样本制备 | 小鼠年龄、每组生物学重复数、每个重复混合小鼠数、目标细胞捕获数、测序平台和读长 阅读提示：Methods中Sample Preparation and Library Construction小节 |
| scRNA-seq数据分析 | 质控阈值、Krt14⁺上皮细胞筛选标准、高变基因数、主成分数、聚类算法、ER容量和UPR特征基因列表 阅读提示：Methods中Data Preprocessing and Cell Annotation和Differential Expression and Functional Analysis小节，以及Supplementary Table S1 |
| 免疫荧光染色 | 抗体稀释比例、切片厚度、抗原修复或通透条件、二抗品牌和货号 阅读提示：Methods中Immunofluorescence Staining小节及Figure 1E、2D图注 |