卵泡中Adropin/GPR19表达与激素调节分析
确定Adropin/GPR19在猪卵泡中的表达、发情周期变化及促性腺激素和类固醇的调控。
分离小、中、大卵泡，检测ENHO/GPR19 mRNA和蛋白及卵泡液Adropin浓度；Gc分别用FSH、LH、P4、T、E2处理48 h后检测Adropin/GPR19表达与分泌；免疫组化定位。
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Adropin对猪颗粒细胞功能和卵母细胞成熟的影响
Adropin effects on granulosa cell function and oocyte maturation in pigs†
实验完整度
高体内卵泡发情周期表达分析、颗粒细胞体外功能与信号通路验证、卵母细胞体外成熟及免疫定位等多层证据
主要模型
猪中等大小卵泡来源颗粒细胞原代培养 猪卵丘-卵母细胞复合体（COCs）体外成熟 发情周期各阶段猪卵巢卵泡组织 未成熟猪卵巢卵母细胞
重点核对
Adropin 0.1、1、10、100 nM处理Gc 48 h，评估活力、增殖与类固醇分泌 10 nM Adropin处理1–45 min检测AKT、ERK1/2、PKA磷酸化 MAP3/1抑制剂PD98059 25 μM、AKT抑制剂LY294002 5 μM、PKA抑制剂KT5720 50 ng/mL预处理1 h FSH、LH 100 ng/mL及P4、T、E2 10−7 M处理Gc 48 h COCs在含或不含10 nM Adropin的TCM199中成熟44 h
摘要
Adropin是一种参与能量稳态的肽，通过G蛋白偶联受体19（GPR19）发挥作用。本研究检测了Adropin/GPR19在猪卵泡中的表达，并在体外评估了Adropin对颗粒细胞（Gc）功能和卵母细胞成熟的影响。分析了发情周期中猪卵泡和卵泡液中Adropin/GPR19的水平。随后，将从中等大小卵泡分离的Gc与促性腺激素、类固醇或Adropin（0.1–100 nM）共培养，利用药理学抑制剂评估Adropin/GPR19表达、Gc功能和信号通路。此外，在未成熟猪的卵丘-卵母细胞复合物体外成熟后，评估了Adropin对卵母细胞成熟的影响。我们注意到，在发情周期中，Adropin在全猪卵泡中的表达增加，而GPR19降低。促性腺激素和类固醇处理增加了Adropin蛋白表达及其向培养基的分泌以及GPR19蛋白。两种蛋白均定位于Gc和卵泡膜细胞。在功能上，Adropin通过AKT信号降低Gc活力，通过ERK1/2抑制增殖和细胞周期进程，通过PKA抑制雌二醇分泌和CYP19A1表达，增加孕酮分泌、cleaved caspase-3表达及其活性，并抑制自噬相关标志物。Adropin同时增强卵丘-卵母细胞复合体中卵母细胞成熟、孕酮分泌和脂质利用。这些发现表明，Adropin可能通过作用于Gc和卵母细胞来调节猪卵泡发育。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Adropin及其受体GPR19是否表达于猪卵泡，以及Adropin是否直接调控猪颗粒细胞功能和卵母细胞体外成熟。
- 核心机制
- Adropin通过AKT降低Gc活力、通过ERK1/2抑制增殖与细胞周期进程、通过PKA抑制雌二醇分泌和CYP19A1表达，同时促进孕酮分泌与凋亡标志物并抑制自噬相关标志物。
- 主要证据
- 猪卵泡发情周期表达与免疫定位、Gc体外活力/增殖/细胞周期/凋亡/自噬/类固醇检测、药理学抑制剂逆转实验、COCs体外成熟及脂滴与ATGL/ADRP表达分析。
- 研究意义
- 提示Adropin可能作为代谢调节因子参与猪卵泡发育调控，并可能为改善猪繁殖及辅助生殖技术和体外成熟体系提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Adropin对Gc活力、增殖和细胞周期的影响
验证Adropin是否影响颗粒细胞存活与增殖。
Gc用0.1–100 nM Adropin处理48 h，alamarBlue检测活力、BrdU检测增殖、流式检测细胞周期，并检测PCNA和cyclin D1表达。
Adropin对Gc类固醇生成的影响
评估Adropin对雌二醇、孕酮分泌及CYP19A1表达的调控。
Gc用0.1–100 nM Adropin处理48 h，ELISA检测E2和P4，RT-qPCR和Western blot检测CYP19A1。
Adropin对Gc凋亡与自噬标志物的影响
判断Adropin是否改变凋亡和自噬相关信号。
检测CASP3、BAX、BCL2、p53、BECN1、LC3、LAMP1的mRNA和蛋白，检测cleaved caspase-3及caspase-3/7活性。
AKT、ERK1/2、PKA通路验证
确定Adropin激活的激酶通路及其对Gc功能的中介作用。
10 nM Adropin处理不同时间检测磷酸化；用PD98059、LY294002、KT5720预处�理后加Adropin 48 h，检测活力、增殖和E2分泌。
Adropin对卵母细胞体外成熟的影响
评估Adropin对COCs成熟、孕酮分泌和脂质代谢的作用。
未成熟猪COCs在含或不含10 nM Adropin的TCM199中成熟44 h，检测MII比例、P4、脂滴和ATGL/ADRP表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞活力检测 | alamarBlue试剂 | Invitrogen | DAL1100 |
| 细胞增殖检测 | BrdU检测试剂盒 | Roche Diagnostics | 11647229001 |
| 卵泡液及培养基Adropin检测 | 猪Adropin酶联免疫试剂盒 | QnD | EIA07297 |
| E2检测 | 雌二醇酶联免疫试剂盒 | DRG Instruments GmbH | EIA-1561 |
| P4检测 | 孕酮酶联免疫试剂盒 | DRG Instruments GmbH | EIA-2693 |
| Caspase-3/7活性检测 | Caspase-Glo 3/7检测试剂 | Promega | G8090 |
| Western blot | Adropin抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-72781 |
| GPR19抗体 | BosterBio | A14590 | |
| Cyclin D抗体 | Abcam | ab134175 | |
| CYP19A1抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-21398 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101S | |
| 总ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271S | |
| 总AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 磷酸化PKA抗体 | Abcam | ab5815 | |
| 总PKA抗体 | Abcam | ab187515 | |
| Caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662S | |
| PCNA抗体 | Thermo Fisher Scientific | 13-3900 | |
| Beclin1抗体 | Cell Signaling Technology | D40C5 | |
| LAMP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9091 | |
| LC3抗体 | Cell Signaling Technology | 12741 | |
| β-actin抗体 | Sigma-Aldrich | A5316 | |
| 抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 488标记抗兔二抗 | Invitrogen | A11008 |
| 免疫组化 | DAB显色剂 | Sigma-Aldrich | -- |
| 脂滴染色 | NileRed染料 | Sigma-Aldrich | -- |
| 信号通路抑制 | PD98059（MAP3/1抑制剂） | -- | -- |
| LY294002（AKT抑制剂） | -- | -- | |
| KT5720（PKA抑制剂） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 卵泡样本采集与发情周期分组 | 猪品种（Large White × Polish Landrace）、月龄7–8个月、发情周期第4–6/10–12/16–18天取样、卵泡大小分级2–4/4–6/8–12 mm、n=6 阅读提示：Methods“Sample collection”及Figure 1图注 |
| Gc培养与激素处理 | 中等卵泡（发情周期第10–12天）来源、5×10^4/孔、M199+1% FBS、FSH/LH 100 ng/mL、P4/T/E2 10−7 M、处理48 h 阅读提示：Methods“Granulosa cells culture and experimental procedure”Experiment 1 |
| Adropin剂量与处理时间 | Adropin 0.1、1、10、100 nM，处理48 h；0.1 nM为生理相关剂量 阅读提示：Methods Experiment 2–5及Discussion剂量说明 |
| 信号通路抑制实验 | PD98059 25 μM、LY294002 5 μM、KT5720 50 ng/mL预处�理1 h，随后10 nM Adropin处理48 h 阅读提示：Methods Experiment 7 |
| 卵母细胞体外成熟 | 未成熟猪4–5个月龄、卵泡3–6 mm、每组12–15个COCs、10 nM Adropin、44 h、39°C、5% CO2/95% O2、n=4 阅读提示：Methods“Oocytes collection and experimental procedure”Experiment 2 |