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        丝氨酸饥饿通过抑制SRSF蛋白的翻译调控mRNA剪接

        Serine Starvation Modulates mRNA Splicing through Translational Inhibition of SRSF Proteins

        作者信息Philippa A Burns, Negar Tabatabaei, Laura M Selfors, Huiping Zhao, Mukhayyo Sultonova, Vipin Rawat, Joao A Paulo, Godwin K Sarpey, Aanshi Vashi, Debolanle O Dahunsi, Mete Emir Ozgurses, Prarthana Prashanth, Hao Fan, Francine E Garrett-Bakelman, Debra A Tonetti, J Patrick Murphy, Soroush Tahmasebi, Svetlana E Semina, Jonathan L Coloff
        PMID42484423
        期刊Cancer Res
        发布时间2026-10-15
        DOI10.1158/0008-5472.CAN-25-4971
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含定量蛋白质组学、RNA-seq、多株细胞系、PDX动物模型及功能与机制验证（CRISPR敲除、翻译报告系统、体内药物联合实验）。

        主要模型

        MCF7乳腺癌细胞系 HCC1806乳腺癌细胞系 HCI-011患者来源异种移植（PDX）模型 UIC#63患者来源异种移植（PDX）模型

        重点核对

        丝氨酸/甘氨酸（S/G）饥饿处理时间：多数实验为48小时，SUnSET实验为4小时，体内饮食实验为14-18天 SRSF6和SRRM2的敲低使用两个独立的sgRNA（sgSRSF6 #1/#2/#3，sgSRRM2 #1/#2） indisulam体内给药剂量为25 mg/kg腹腔注射，5天给药2天停药，共两个周期 定量蛋白质组学和RNA-seq均使用三个生物学重复 S/G饥饿培养基为不含S/G的HPLM，回补时使用100× S/G储液

        摘要

        丝氨酸是癌症细胞增殖的关键营养物，具有众多下游生物合成功能。鉴于目前临床上正在努力利用膳食丝氨酸饥饿作为丝氨酸营养缺陷型肿瘤的潜在疗法，了解癌症细胞如何响应丝氨酸饥饿非常重要。在本研究中，我们证明丝氨酸饥饿诱导mRNA剪接的剧烈变化。这些效应部分是由于富含丝氨酸的蛋白质翻译减少，包括已知的mRNA剪接调节因子——富含丝氨酸/精氨酸的剪接因子（SRSF）蛋白。实际上，在丝氨酸营养缺陷型癌症细胞中，丝氨酸饥饿导致SRSF6的翻译减少，并促成了丝氨酸剥夺后观察到的RNA剪接变化。此外，在没有外源性丝氨酸的情况下，SRSF6的减少影响DNA损伤反应和细胞存活，而RNA剪接调节剂与膳食丝氨酸饥饿联合使用可抑制肿瘤生长。总的来说，这项工作描述了丝氨酸在支持mRNA剪接中的基本作用，这可能对将膳食丝氨酸饥饿推向临床的努力具有启示意义。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        丝氨酸饥饿如何影响癌症细胞的蛋白质表达和mRNA剪接，以及这种响应是否可用于增强丝氨酸营养缺陷型肿瘤的治疗效果。
        核心机制
        丝氨酸饥饿导致核糖体在TCC丝氨酸密码子处停滞/脱落，抑制富含丝氨酸的剪接因子（如SRSF6）的翻译，进而改变mRNA剪接，影响DNA损伤反应和细胞存活。
        主要证据
        定量蛋白质组学显示丝氨酸饥饿后富含丝氨酸蛋白（包括SRSF6和SRRM2）减少；RNA-seq和rMATS分析显示大量差异剪接事件；SRSF6敲低重现部分剪接变化；SRSF6 mut(AGC)抵抗降解并部分挽救剪接变化；SRSF6敲低增加DNA损伤标志物p-H2AX和细胞死亡；体内实验显示S/G饥饿饮食联合indisulam抑制肿瘤生长。
        研究意义
        揭示了丝氨酸在支持mRNA剪接中的基本作用，为将膳食丝氨酸饥饿与剪接调节剂联合用于治疗丝氨酸营养缺陷型肿瘤提供了临床前依据。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        丝氨酸饥饿对蛋白质组和基因表达的影响

        探究丝氨酸饥饿如何重塑癌症细胞的蛋白质组，并鉴定对丝氨酸敏感的蛋白质类别。

        对MCF7（丝氨酸营养缺陷型）和HCC1806（非营养缺陷型）细胞进行S/G饥饿48小时，进行定量TMT蛋白质组学和RNA-seq分析，比较蛋白质和mRNA变化，并进行通路富集分析。

        2

        丝氨酸饥饿对pre-mRNA剪接的影响

        评估丝氨酸饥饿是否诱导选择性剪接变化，并确定这些变化是否依赖丝氨酸营养缺陷。

        对S/G饥饿前后的MCF7、MDAMB453、HCC1806和SUM149细胞进行RNA-seq，使用rMATS分析差异剪接事件；通过过表达PSAT1（MCF7）或CRISPR敲除PSAT1（HCC1806）改变营养缺陷状态，评估剪接变化；在HCI-011 PDX模型中用S/G缺乏饮食处理18天，分析肿瘤RNA剪接。

        3

        SRSF6和SRRM2在丝氨酸饥饿诱导剪接变化中的作用

        验证SRSF6和SRRM2的减少是否贡献于丝氨酸饥饿诱导的剪接变化。

        用CRISPR/Cas9构建SRSF6或SRRM2敲低的MCF7细胞，进行RNA-seq和rMATS分析，比较敲低细胞与S/G饥饿细胞的差异剪接事件重叠。

        4

        丝氨酸饥饿抑制SRSF6翻译的机制

        探究丝氨酸饥饿是否通过核糖体停滞/脱落抑制SRSF6翻译，并评估GCN2和mTORC1通路的作用。

        进行多聚核糖体谱分析、SUnSET实验、GCN2抑制剂（GCN2iB）、ISRIB、everolimus处理；使用核糖体停滞和脱落报告系统检测TCC和AGC丝氨酸密码子；构建SRSF6 WT和mut(AGC)过表达细胞，检测蛋白质稳定性和剪接挽救。

        5

        SRSF6缺失对DNA损伤反应和细胞存活的影响

        评估SRSF6减少如何影响DNA损伤反应和细胞死亡。

        在S/G饥饿或DNA损伤剂处理下，检测p-H2AX和53BP1 foci（Western blot和免疫荧光），用流式细胞术或Celigo计数死细胞（PI/Hoechst），并进行集落形成实验。

        6

        丝氨酸饥饿与剪接体抑制剂的联合效果

        测试S/G饥饿或SRSF6敲低是否增强细胞对剪接体抑制剂的敏感性，并在体内评估联合治疗效果。

        用indisulam或H3B-8800处理MCF7细胞（±S/G饥饿或sgSRSF6），检测细胞死亡和集落形成；在UIC#63 PDX模型中，给予S/G缺乏饮食联合indisulam（25 mg/kg腹腔注射）治疗，监测肿瘤体积。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证样本或模型特征
        短串联重复序列分析支原体检测
        验证细胞功能变化
        细胞计数集落形成实验流式细胞术Celigo成像细胞术
        验证分子表达变化
        Western blot定量多重TMT蛋白质组学RNA测序半定量RT-PCR
        验证翻译调控
        多聚核糖体分离分析SUnSET实验
        验证机制链路
        CRISPR/Cas9敲除慢病毒过表达shRNA敲低核糖体停滞报告实验免疫荧光选择性剪接分析（rMATS）
        评估体内效果
        患者来源异种移植模型肿瘤体积测量
        代谢物分析
        气相色谱-质谱联用
        数据分析与统计
        基因本体（GO）分析超几何重叠分析SuperExactTestWelch t检验双因素方差分析线性混合模型

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        细胞培养透析胎牛血清Sigma-AldrichF0392
        青霉素/链霉素Gibco15140-122
        动物实验17β-雌二醇Sigma-AldrichE2758
        indisulamSelleck ChemicalsS9742
        药物处理嘌呤霉素Sigma-AldrichP8833
        GCN2iBSelleck ChemicalsS8929
        ISRIBMillipore SigmaSML0843
        依维莫司Selleck ChemicalsS1120
        甲氧苄啶Sigma-AldrichT7883
        洛美曲索Sigma-AldrichSML0040
        甲氨蝶呤Selleck ChemicalsS1210
        紫杉醇Selleck ChemicalsS1150
        依托泊苷Selleck ChemicalsS1225
        帕博西尼Selleck ChemicalsPD-0332991
        indisulam（体外用）Sigma-AldrichSML1225-5MG
        SHIN1MedChemExpressHY-112066A
        5-氟尿嘧啶Selleck ChemicalsS1209
        6-巯基嘌呤Selleck ChemicalsS1305
        多柔比星Selleck ChemicalsS1208
        H3B-8800MedChemExpressHY-111517
        过氧化氢Sigma-AldrichH1009
        Western blotRIPA裂解液Thermo Fisher Scientific89901
        蛋白酶抑制剂混合物Thermo Fisher Scientific87786
        磷酸酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP0044
        磷酸酶抑制剂混合物Sigma-AldrichP5726
        BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
        Laemmli SDS上样缓冲液Thermo Fisher ScientificJ61337
        4-20% Tris-Glycine凝胶Thermo Fisher ScientificXP04205BOX
        Immobilon-P PVDF膜Millipore SigmaIPVH00010
        Immobilon-PSQ PVDF膜Millipore SigmaISEQ00010
        牛血清白蛋白Sigma-Aldrich12659
        脱脂奶粉RPIM17200-500.0
        PSAT1抗体Thermo Fisher ScientificPA5-22124
        PHGDH抗体Sigma-AldrichHPA021241
        PSPH抗体（H-11）Santa Cruz Biotechnologysc-365183
        嘌呤霉素抗体Sigma-AldrichMABE343
        ATF4抗体Cell Signaling Technology11815
        磷酸化GCN2 (T899)抗体Cell Signaling Technology94668
        总GCN2抗体Thermo Fisher ScientificPA5-17523
        磷酸化eIF2α (S51)抗体Cell Signaling Technology3398
        磷酸化eIF2α (S51)抗体Abcamab32157
        总eIF2α抗体Santa Cruz Biotechnologysc-133132
        磷酸化p70 S6激酶 (T389)抗体Cell Signaling Technology9234
        总p70 S6激酶抗体Cell Signaling Technology34475
        FLAG抗体Sigma-AldrichF3165
        SRSF6抗体Millipore SigmaMABE152
        SRRM2抗体Thermo Fisher ScientificPA5-66827
        磷酸化S6 (S240/S244)抗体Cell Signaling Technology5364
        S6核糖体蛋白抗体Cell Signaling Technology2317
        磷酸化Rb (S780)抗体Cell Signaling Technology9307
        磷酸化H2AX (S51)抗体Millipore Sigma05-636
        总H2AX抗体Cell Signaling Technology2595
        肌动蛋白抗体Sigma-AldrichA1978
        HRP标记兔二抗Cell Signaling Technology7074
        HRP标记鼠二抗Cell Signaling Technology7076
        SuperSignal West Pico PLUS化学发光底物Thermo Fisher Scientific34580
        SuperSignal West Femto最高灵敏度底物Thermo Fisher Scientific34095
        RNA提取TRIzol试剂Thermo Fisher Scientific15596018
        RT-PCRqScript cDNA合成试剂盒QuantaBio95047
        Taq DNA聚合酶New England BiolabsM0273S
        流式分析Beckman Coulter CytoFLEX S流式细胞仪Beckman Coulter--
        细胞死亡检测Hoechst 33342InvitrogenH1399
        碘化丙啶InvitrogenP3566
        SYTOX GreenInvitrogenS7020
        免疫荧光53BP1抗体Novus BiologicalsNB100-304
        磷酸化H2AX (S51)抗体Sigma-Aldrich05-636
        Alexa Fluor 488驴抗鼠二抗Thermo Fisher ScientificA21202
        Alexa Fluor 594驴抗兔二抗Thermo Fisher ScientificA21207
        含DAPI的ProLong Gold抗淬灭封片剂InvitrogenP36931
        GC-MS13C6-葡萄糖Cambridge Isotope Laboratories--
        MOX试剂Thermo Fisher ScientificPI45950
        克隆形成实验结晶紫Thermo Fisher ScientificC581
        慢病毒包装聚乙烯亚胺Polysciences23966
        慢病毒感染聚凝胺（溴化己二甲铵）Sigma-AldrichH9268

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        S/G饥饿处理
        培养基类型（HPLM或RPMI）、血清浓度（5%透析FBS）、S/G饥饿持续时间（4、24或48小时，依实验而定）
        阅读提示：Methods 'Standard cell culture and media'；Figure legends 1A、4B、5C等
        定量蛋白质组学
        细胞系（MCF7或HCC1806）、S/G饥饿48小时、三个生物学重复、TMT 16-plex标记、质谱平台（Orbitrap Fusion Lumos）
        阅读提示：Methods 'Quantitative multiplexed TMT proteomics and MS2'；Figure 1A和1B legend
        RNA-seq和剪接分析
        三个独立实验同时测序、rMATS版本（v4.1.2、v4.2.0、v4.3.0）、FDR阈值（P < 0.05）、基因组注释（GRCh38/hg38）
        阅读提示：Methods 'RNA sequencing'和'Alternative splicing analysis'；Figure 2 legend
        PDX体内实验
        PDX模型（HCI-011或UIC#63）、肿瘤接种体积（2×4 mm碎片）、饮食处理时间（HCI-011 18天；UIC#63 14天）、indisulam剂量（25 mg/kg）和给药方案（5天给药2天停药，两个周期）、每组肿瘤数（n=8-10）
        阅读提示：Methods 'In vivo xenograft studies'；Figure 6F legend
        SRSF6敲低和过表达
        sgRNA序列（sgSRSF6 #1、#2、#3）、过表达构建体（SRSF6 WT和mut(AGC)）、慢病毒感染和抗生素筛选条件
        阅读提示：Methods 'CRISPR knockout and overexpression, other plasmids'；Figure 3G和J legend；Figure 4J legend
        翻译检测（多聚核糖体谱和SUnSET）
        多聚核糖体谱：MCF7或HCC1806细胞、S/G饥饿48小时、CHX浓度（100 μg/mL）；SUnSET：嘌呤霉素浓度（10 μg/mL）、孵育时间（10分钟）、追踪时间（30分钟）
        阅读提示：Methods 'Polysome fractionation analysis'和'SUnSET (puromycin incorporation) assay'；Figure 4A-C legend

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