CRLM中性粒细胞浸润与临床预后分析
评估中性粒细胞在CRLM中的浸润动态及与预后的关系
对配对原发结直肠癌与肝转移灶进行免疫谱比较，免疫荧光检测MPO，并按MPO密度中位数将127例CRLM患者分为高/低浸润组进行生存分析
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衰老样中性粒细胞塑造结直肠癌肝转移中的血管生成免疫抑制微环境
Senescent-Like Neutrophils Shape Angiogenic Immunosuppressive Niches in Colorectal Cancer Liver Metastasis
实验完整度
高含患者样本scRNA-seq与Stereo-seq、细胞系体外实验、多种小鼠CRLM模型及条件敲除体内功能验证
主要模型
结直肠癌肝转移患者组织与外周血样本 人结直肠癌细胞系HCT116和DLD-1及dHL60细胞 MC38与CT26小鼠结直肠癌肝转移模型 中性粒细胞特异性Bhlhe40条件敲除小鼠
重点核对
TAN1_LGALS3在CRLM中富集并与不良预后相关（n=127队列，MPO高/低分组） LGALS3+中性粒细胞的SA-β-Gal活性高于LGALS3−中性粒细胞（CRLM患者n=3） 葡萄糖剥夺24小时上调中性粒细胞BHLHE40蛋白及Gal3表达 LGALS3+中性粒细胞条件培养基促进HUVEC成管（n=6） BX471或抗CCL3L1抗体阻断后巨噬细胞趋化受损（n=6）
摘要
中性粒细胞是天然免疫的主要参与者，但其在结直肠癌肝转移（CRLM）中的景观和功能仍知之甚少。在本研究中，我们利用单细胞RNA测序和空间增强分辨率组学测序，提供了CRLM中肿瘤相关中性粒细胞（TAN）的全面转录景观。我们的分析揭示，一个终末分化的促肿瘤中性粒细胞亚群（TAN1），以糖酵解特征和衰老表型为特征，在肝转移中显著富集并与不良预后相关。在机制上，TAN1由其他TAN亚群通过上调BHLHE40而产生，后者由转移微环境中的葡萄糖剥夺驱动。在功能上，TAN1通过VEGFA促进血管生成，并通过潜在的CCL3L1–CCR1信号招募免疫抑制性巨噬细胞，从而培育血管生成免疫抑制微环境。因此，小鼠中性粒细胞特异性敲除Bhlhe40显著促进抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长。我们的数据揭示了BHLHE40+衰老样中性粒细胞在塑造CRLM免疫抑制微环境中的关键作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CRLM中肿瘤相关中性粒细胞的景观、功能多样性及其调控机制是什么。
- 核心机制
- 转移微环境中葡萄糖剥夺驱动中性粒细胞上调BHLHE40，直接调控LGALS3、VEGFA、LDHA和CDKN1A等基因，形成糖酵解和衰老样促肿瘤表型；该亚群通过VEGFA促进血管生成，并通过CCL3L1–CCR1信号招募免疫抑制性巨噬细胞。
- 主要证据
- 基于6例CRLM患者样本的微孔板scRNA-seq（52,198个中性粒细胞）和Stereo-seq空间转录组鉴定TAN1_LGALS3；体外dHL60敲低/过表达及ChIP验证BHLHE40调控；LGALS3+中性粒细胞成管实验和巨噬细胞迁移实验；多种小鼠CRLM模型中过继转移及中性粒细胞特异性Bhlhe40敲除验证体内功能。
- 研究意义
- 揭示BHLHE40+衰老样中性粒细胞在塑造CRLM免疫抑制微环境中的关键作用，提示其作为中性粒细胞特异性治疗干预的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞过继转移与清除的体内功能验证
验证中性粒细胞对CRLM进展的作用
在MC38和CT26脾内注射、直肠原位及肝原位种植模型中过继转移骨髓来源中性粒细胞或使用抗Ly6G抗体清除中性粒细胞，检测肝转移和肿瘤生长
单细胞与空间转录组鉴定TAN亚群
刻画CRLM中性粒细胞的转录景观和空间分布
对6例CRLM患者的外周血、肝转移灶、癌旁肝组织和原发灶样本进行微孔板scRNA-seq，并对10例CRLM和3例原发灶组织进行Stereo-seq
TAN1_LGALS3代谢与衰老表型验证
确认TAN1_LGALS3的糖酵解和衰老样特征
使用scMetabolism、SenCID评分及SASP基因、CDKN1A表达分析，mIHC检测p21+中性粒细胞，流式检测SA-β-Gal活性
TAN1_LGALS3来源与组织定向分化验证
确定TAN1_LGALS3是经组织定向分化而非主动招募形成
分析趋化因子受体表达、CytoTRACE与Monocle 2轨迹、TAN1相似性评分，并将外周血中性粒细胞与HCT116或DLD-1共培养检测表型转换
BHLHE40调控机制验证
确认BHLHE40对促肿瘤转录程序的直接调控及葡萄糖剥夺的驱动作用
SCENIC分析转录因子活性，dHL60敲低和过表达BHLHE40，ChIP验证启动子结合；低糖培养中性粒细胞检测BHLHE40蛋白、Gal3、糖酵解速率及ATAC-seq染色质可及性
血管生成与免疫抑制微环境功能验证
验证TAN1_LGALS3促血管生成和招募免疫抑制巨噬细胞的功能
CD31 IHC与TAN1密度相关性分析，LGALS3+中性粒细胞条件培养基HUVEC成管实验，CellChat分析配体-受体，BX471或抗CCL3L1阻断的巨噬细胞迁移实验，mIHC和Stereo-seq分析空间生态位，LGALS3+与LGALS3−中性粒细胞过继转移比较
中性粒细胞特异性Bhlhe40敲除体内验证
评估靶向中性粒细胞BHLHE40对CRLM进展和抗肿瘤免疫的影响
构建Mrp8-Cre; Bhlhe40flox/flox小鼠，建立MC38脾内注射和肝原位种植CRLM模型，检测肿瘤负荷、免疫细胞浸润，并对WT和KO小鼠肿瘤进行scRNA-seq
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞与空间转录组分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500 |
| 胎牛血清 | Pricella | 164210 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| McCoy's 5A培养基 | Pricella | PM150710 | |
| Iscove改良Dulbecco培养基 | Gibco | 12440053 | |
| EGM-2内皮细胞生长培养基-2试剂盒 | Lonza Bioscience | CC-3162 | |
| 免疫组化 | EDTA缓冲液 | Solarbio | C1034 |
| 山羊血清 | Solarbio | SL038 | |
| 双染免疫组化试剂盒 | Zsbio | DS-0004 | |
| KF-PRO-020数字切片扫描仪 | KFBIO | -- | |
| 多重免疫组化 | TSA多重免疫组化检测试剂盒 | TissueGnostics | TGT5C100 |
| HRP标记抗小鼠二抗 | Abcam | ab205719 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 封片剂 | Panovue | 0022001010 | |
| TissueFAXS SPECTRA成像系统 | TissueGnostics | -- | |
| 流式分析 | 可固定活性染料 | BD Biosciences | 565694 |
| Aurora流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录预混试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Bio | -- | |
| QuantStudio 7 Flex实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme | ZJ101 |
| 抗人BHLHE40抗体 | Proteintech | 17895-1-AP | |
| 动物实验 | EasySep小鼠中性粒细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19762 |
| 抗IgG抗体（克隆2A3） | Bio X Cell | BE0012 | |
| 抗Ly6G抗体（克隆1A8） | Bio X Cell | BE0075 | |
| 抗小鼠CD8a抗体 | Bio X Cell | BE0061 | |
| 慢病毒转导 | Lipofectamine 3000试剂 | Invitrogen | -- |
| 聚凝胺 | Solarbio | -- | |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | -- | |
| 低糖培养 | 低糖DMEM | Gibco | 11885084 |
| 中性粒细胞分离 | PMN分离试剂盒 | Solarbio | P9040 |
| 巨噬细胞迁移实验 | Transwell小室 | Corning | #3422 |
| BX471（CCR1抑制剂） | MedChemExpress | HY-12080 | |
| CCL3L1封闭抗体 | Abcam | ab259372 | |
| SA-β-Gal检测 | CellEvent衰老绿色流式检测试剂盒 | Invitrogen | C10840 |
| T细胞抑制实验 | EasySep人CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | 17953 |
| Dynabeads人T细胞激活剂CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11131D | |
| 重组IL2 | PeproTech | 200-02 | |
| ROS检测 | DCFDA（活性氧探针） | MedChemExpress | HY-D0940 |
| NET检测 | SYTOX Green染料 | -- | -- |
| Olympus FV3000共聚焦荧光显微镜 | Olympus | -- | |
| 糖酵解速率检测 | Seahorse XF糖酵解速率检测试剂盒 | Agilent Technologies | 103344-100 |
| Agilent Seahorse 96XF分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Cell-Tak细胞黏附剂 | Corning | 354240 | |
| ChIP | NovoNGS CUT&Tag 2.0高灵敏度试剂盒 | Novoprotein | N259-YH01 |
| 抗人BHLHE40抗体 | Novus Biologicals | NB100-1800 | |
| ATAC-seq | Illumina NextEra试剂盒转座酶 | Illumina | 15028252 |
| QIAGEN MinElute PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | 28004 | |
| 单细胞测序 | MACS肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-095-929 |
| 多组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-110-201 | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi Biotec | 130-094-183 | |
| BD Rhapsody单细胞系统 | BD Biosciences | -- | |
| Stereo-seq | DNA纯化磁珠 | Vazyme Biotech | N411 |
| KAPA HiFi Hotstart预混液 | Roche | KK2601 | |
| MGI DNBSEQ-T10测序仪 | MGI | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRLM中性粒细胞预后队列 | 患者纳入标准、MPO密度中位数分组依据、随访时间及多因素Cox协变量 阅读提示：Methods Human Specimens及Supplementary Table S1，Figure 1G–I图注 |
| 小鼠CRLM模型建立与给药 | 细胞接种数量（MC38/CT26 5×10^5脾内、2×10^5直肠原位）、给药剂量与频率（中性粒细胞3×10^6每3天、抗Ly6G 200 μg每3天、抗CD8a 200 μg每周两次）、取材时间第14天 阅读提示：Methods Tumor Models and Treatments及Figure 1J、5M、6G、7C图注 |
| scRNA-seq中性粒细胞富集与测序 | FACS门控（Fvs−CD45+CD11b+CD15+CD16+）、中性粒细胞回掺比例、BD Rhapsody建库流程及质控阈值 阅读提示：Methods Single-Cell Preparation, Library Preparation, and Sequencing及Preprocessing of scRNA-seq Data |
| Stereo-seq空间分析 | 切片厚度7 μm、bin50策略（50×50 DNB，直径25 μm）、TAN1high/low按中位数评分定义、生态位距离阈值100 μm及侵袭边缘250 μm定义 阅读提示：Methods Stereo-seq Experiments、Stereo-seq Spatial Transcriptomics Data Analysis及Figure 6B图注 |
| 葡萄糖剥夺体外处理 | 低糖DMEM具体葡萄糖浓度、处理时间24小时、中性粒细胞来源与培养条件 阅读提示：Methods In Vitro Culture Assay及Figure 4J–N图注 |
| BHLHE40敲低/过表达与ChIP | shRNA序列、嘌呤霉素筛选浓度5 μg/mL、polybrene 8 μg/mL、ChIP抗体用量2 μg及Tn5 tagmentation条件 阅读提示：Methods Lentiviral Transduction and Plasmid Construction、ChIP及Supplementary Table S5 |
| 中性粒细胞特异性Bhlhe40敲除模型 | Mrp8-Cre; Bhlhe40flox/flox与WT对照基因型、敲除效率验证方式、成瘤模型与取材时间 阅读提示：Methods Tumor Models and Treatments及Figure 7A–C图注 |
| 巨噬细胞迁移与成管实验 | THP-1来源巨噬细胞诱导条件、BX471 1 μmol/L与抗CCL3L1 1 μg/mL用量、HUVEC接种数1×10^4及孵育4–6小时 阅读提示：Methods In Vitro Macrophage Migration Assay、Tube Formation Assay of Endothelial cells及Figure 5F、5K图注 |