全癌种EP300/CBP依赖性与JQAD1敏感性分析
确定EP300是否较CBP在多数癌症谱系中为更富集的遗传依赖，并筛选对EP300降解剂敏感的谱系。
分析DepMap 24Q2中1,372个细胞系的CHRONOS依赖评分及CCMA数据，并按谱系比较EP300与CBP依赖比例；重新分析JQAD1在544个细胞系中的PRISM筛选数据。
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失调的AKT信号重编程骨肉瘤以驱动对EP300的选择性依赖
Dysregulated AKT signaling reprograms osteosarcoma to drive selective reliance on EP300
实验完整度
高依赖DepMap/CCMA组学、OS细胞系与PDX、CRISPR敲除、RNA-seq/ChIP-seq、体内原位异种移植及>850细胞系PRISM筛选
主要模型
OS PDX来源细胞系（OS052、OS525、OS384等） 常规OS细胞系（OS252、U2OS、SJSA1、143B等） OS052/OS525原位异种移植NMRI-nu/nu小鼠模型 27例OS PDX及331例AACR GENIE患者样本
重点核对
JQAD1处理剂量范围（100 nM–10 μM）及处理时间（3天、48 h、14天等） AKT失调与c-MYC扩增OS细胞系的遗传分组标准（PTEN缺失、AKT1扩增等） 体内JQAD1 20 mg/kg/day腹腔注射、MK-2206 120 mg/kg每周三次口服灌胃及分组样本量 CRISPR sgRNA靶向EP300/CBP及LACZ/ch2.2对照的集落形成验证 PRISM筛选中JQAD1 1 μM锚定剂量与AKT抑制剂剂量反应及MSS计算
摘要
癌症依赖转录调控来维持恶性细胞状态。EP300和CBP是控制正常和恶性转录的旁系同源主表观遗传酶。利用全癌种整合化学-遗传学分析，我们证明，与CBP相比，来自大多数癌症谱系（包括致死性骨肉瘤（OS））的细胞系对EP300的依赖性增强。使用选择性EP300降解剂（JQAD1），我们发现，一个由PI3K–AKT–mTOR通路失调定义的遗传学亚组OS，在遗传学和化学上对EP300缺失敏感。活化的AKT促进对JQAD1的敏感性，其驱动因素是EP300、CBP和H3K27ac重新定位到遗传亚型富集的依赖位点。AKT抑制与JQAD1联合在体外和原位异种移植中协同抑制AKT失调OS细胞的生长。这些观察结果在>850个癌细胞系中得到延伸，其中协同作用可通过升高的蛋白质合成速率预测。这些发现揭示了EP300降解剂在OS中功能的决定因素，并为在蛋白质翻译增强的癌症中共同靶向EP300和AKT提供了基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EP300相对于CBP是否为多数癌症谱系（尤其骨肉瘤）的选择性依赖，以及何种遗传背景决定OS对EP300降解剂JQAD1的敏感性及其与AKT抑制的联合效应。
- 核心机制
- AKT失调通过驱动EP300、CBP和H3K27ac在全基因组依赖位点的重新定位，重编程转录以表达OS生长所需的基因，从而使AKT失调OS对EP300降解敏感；AKT抑制剂与JQAD1协同与抑制蛋白合成相关。
- 主要证据
- DepMap/CCMA显示EP300较CBP更常为依赖；JQAD1剂量依赖抑制AKT失调OS PDX细胞生长并降解EP300、降低c-MYC、诱导cleaved PARP1；myr-AKT使JQAD1不敏感细胞增敏；RNA-seq/ChIP-seq显示EP300、CBP、H3K27ac重定位；MK-2206+JQAD1在体外和OS052/OS525原位异种移植中协同抑制生长并延长生存；>850细胞系PRISM筛选显示协同与蛋白翻译特征相关。
- 研究意义
- 研究揭示EP300降解剂在OS中功能的决定因素，为在AKT失调且蛋白翻译增强的癌症中共同靶向EP300和AKT提供基础，并提示AKT失调OS这一遗传学定义的高危亚型可能对联合治疗有突出反应。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
OS遗传亚型分类与AKT失调验证
确定OS细胞系和PDX中与EP300依赖相关的遗传事件，并验证其是否对应AKT通路激活。
对27个OS细胞系整合CCLE拷贝数与突变数据，分为AKT失调、c-MYC扩增或未知；对27例OS PDX进行WGS和RNA-seq，并用phospho-Ser473-AKT免疫组化评分；分析331例AACR GENIE OS患者样本。
JQAD1及EP300遗传缺失对OS细胞生长的影响
验证AKT失调OS细胞对EP300降解或遗传缺失的敏感性，并明确其与c-MYC、CRBN的关系。
用JQAD1处理常规和PDX来源OS细胞系，行CellTiter-Glo和集落形成实验；用Cas9联合sgRNA靶向EP300、CBP、LACZ或基因沙漠进行集落形成实验；western blot检测EP300、CBP、c-MYC、cleaved PARP1、CRBN及磷酸化AKT。
AKT失活与AKT过表达对JQAD1敏感性的因果验证
检验AKT活性是否足以驱动JQAD1敏感性，并排除c-MYC和CRBN的介导作用。
在JQAD1敏感细胞中过表达c-MYC；在JQAD1不敏感OS152和OS186中过表达myristoylated-AKT1；用CellTiter-Glo和western blot评估生长及EP300降解；用pomalidomide竞争实验验证降解机制。
AKT驱动的转录与表观遗传重定位分析
确定AKT失调是否通过EP300、CBP和H3K27ac重定位重编程OS转录组及遗传依赖基因表达。
对JQAD1敏感与不敏感OS细胞及OS152-EV与OS152-myr-AKT细胞进行RNA-seq和针对EP300、CBP、H3K27ac的ChIP-seq；整合DepMap依赖数据；用JQAD1处理OS525后行spike-in RNA-seq。
AKT抑制剂与EP300降解剂体外联合效应评估
检验MK-2206与JQAD1在AKT失调OS细胞中是否协同抑制生长，并比较与HAT/BRD抑制剂联合的差异。
在OS PDX细胞系中进行JQAD1与MK-2206、A485或CCS1477的剂量反应联合处理，CellTiter-Glo检测生长，ZIP模型评估协同；western blot检测CRBN、EP300、CBP及蛋白合成通路磷酸化状态。
跨癌种PRISM联合筛选与蛋白合成机制分析
确定JQAD1与AKT抑制剂的协同是否跨癌种存在，并检验蛋白合成速率与协同的关系。
用PRISM条形码细胞系平台测试MK-2206或capivasertib剂量反应联合JQAD1 1 μM锚定剂量；计算MSS并用GSEA分析协同与拮抗细胞系的转录特征；用puromycin标记检测新生蛋白合成。
AKT失调OS原位异种移植体内联合验证
在体内验证JQAD1与MK-2206联合对AKT失调OS生长的抑制和生存获益。
将OS052或OS525细胞原位接种至NMRI-nu/nu小鼠胫骨旁，肿瘤可触及后随机分组给予vehicle、JQAD1、MK-2206或联合，监测肿瘤体积、生存、micro-CT及IHC。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | JQAD1 | Qi laboratory (Dana-Farber Cancer Institute) | -- |
| A485 | Qi laboratory (Dana-Farber Cancer Institute) | -- | |
| CCS1477 | Qi laboratory (Dana-Farber Cancer Institute) | -- | |
| 泊马度胺 | Combi-Blocks Inc. | -- | |
| MK-2206 | Selleck Chemicals | NC0709830 | |
| capivasertib | -- | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺 | Gibco | -- | |
| RPMI培养基 | Gibco | -- | |
| McCoy’s 5A培养基 | Gibco | -- | |
| Schneider培养基 | Gibco | -- | |
| 稳定细胞系构建 | TransIT-293转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| Lenti-X浓缩试剂 | Takara Bio Inc. | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | -- | -- | |
| Western blot | NE-PER核裂解试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 4–12% Bis-Tris NuPAGE凝胶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 4–20% TGX免染凝胶 | Bio-Rad | -- | |
| 抗嘌呤霉素抗体 | Abcam | Ab315887 | |
| 抗c-MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 5605S | |
| 抗总H3抗体 | Millipore | 04928MI | |
| 抗EP300抗体 | Cell Signaling Technology | 70088S | |
| 抗CBP抗体 | Cell Signaling Technology | 7389S | |
| 抗AKT1抗体 | Cell Signaling Technology | 9272S | |
| 抗cleaved-PARP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9542S | |
| 抗磷酸化Ser473 AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060T | |
| 抗磷酸化Thr389 p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 9234T | |
| 抗总p70S6K抗体 | Cell Signaling Technology | 2708T | |
| 抗磷酸化S6 (Ser235/236)抗体 | Cell Signaling Technology | 4858T | |
| 抗磷酸化S6 (Ser240/244)抗体 | Cell Signaling Technology | 5364T | |
| 抗总S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217S | |
| 抗磷酸化Ser209 EIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 9741T | |
| 抗总EIF4E抗体 | Cell Signaling Technology | 9742S | |
| 抗磷酸化Thr37/46 4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855T | |
| 抗总4E-BP1抗体 | Cell Signaling Technology | 9452S | |
| 抗PTEN抗体 | Cell Signaling Technology | 9552 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967S | |
| 抗vinculin抗体 | Millipore | MAB3574 | |
| 抗Lamin B1抗体 | Abcam | ab16048 | |
| 抗CRBN抗体 | Cell Signaling Technology | 71810S | |
| HRP标记抗兔或抗鼠二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Clarity Max Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| 抗兔IR-680或抗鼠IR-800二抗 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo检测试剂盒 | Promega | -- |
| TECAN D300e机器人辅助化合物分配器 | TECAN Ltd | -- | |
| Envision 2104读板仪 | PerkinElmer | -- | |
| 流式分析 | BD LSRFortessa细胞分析仪 | BD Biosciences | -- |
| Western blot | 放射免疫沉淀分析缓冲液 | Pierce Biosciences | -- |
| 磷酸酶和蛋白酶抑制剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Ambion | -- |
| ERCC RNA对照 | ThermoFisher | 4456740 | |
| Qiagen RNeasy试剂盒 | Qiagen | -- | |
| Quant-iT RiboGreen RNA检测 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 4200 TapeStation高灵敏度RNA ScreenTape检测 | Agilent | -- | |
| Illumina链特异性总RNA文库制备试剂盒 | Illumina | PN 20040529 | |
| ChIP-seq | 抗EP300 ChIP抗体 | Abcam | ab10485 |
| 抗CBP ChIP抗体 | Cell Signaling Technology | 7389 | |
| 抗H3K27ac ChIP抗体 | Abcam | ab4729 | |
| 免疫组化 | 抗CBP抗体 | Cell Signaling | 7389 |
| 抗cleaved caspase 3抗体 | Cell Signaling | 9664 | |
| 抗Ki67抗体 | R&D Systems | MAB7617 | |
| 抗磷酸化Ser473 AKT抗体 | Cell Signaling | 4060 | |
| 抗p300抗体 | Bethyl Laboratories | IHC-00028 | |
| 抗磷酸化Thr389 p70S6K抗体 | Millipore Sigma | SAB 4503957 | |
| 抗磷酸化Thr37/46 4EBP1抗体 | Cell Signaling | 2855 | |
| Ventana DISCOVERY ULTRA染色平台 | Roche Diagnostics Corporation | -- | |
| Leica Bond Rx染色平台 | Leica Biosystems | -- | |
| DISCOVERY细胞条件处理液1 | Roche Diagnostics Corporation | 06414575001 | |
| BOND抗原修复液2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| Ventana DISCOVERY OmniMap抗兔HRP检测系统 | Roche Diagnostics Corporation | 760-4311 | |
| BOND聚合物精制检测系统 | Leica Biosystems | DS9800 | |
| DISCOVERY HQ信号放大试剂盒 | Roche Diagnostic Systems | 06472320001 | |
| 组织处理 | HistoCore PEGASUS组织处理器 | Leica Biosystems | -- |
| HistoCore AUTOCUT全自动轮转切片机 | Leica Biosystems | -- | |
| HistoCore SPECTRA ST染色机 | Leica Biosystems | -- | |
| 成像 | Olympus BX46显微镜 | Evident Scientific | -- |
| Spot Insight Color Mosaic显微镜相机 | Spot Imaging | -- | |
| 动物实验 | 高分辨率微型CT扫描仪Skyscan 1,276 | Bruker | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OS细胞系遗传亚型分类 | AKT失调与c-MYC扩增分类标准：拷贝数变化阈值（log2Copy number ≤ 0.7为丢失，≥ 1.5为增加，≥ 3为高拷贝增加）及候选基因列表 阅读提示：Materials and methods中“Assignment of AKT-dysregulated or MYC-amplified status to OS cell lines and dependency analysis”，并对照Fig. 1 E、G及Fig. S1 H |
| JQAD1体外生长抑制与集落形成 | JQAD1剂量范围、处理时间（3天CellTiter-Glo或14天集落形成）、重复数（n = 3或n = 4独立生物学重复，四技术重复） 阅读提示：Materials and methods“Cell growth and differentiation assays”及Fig. 1 F、Fig. 2 A图注 |
| CRISPR-Cas9 EP300/CBP敲除 | sgRNA序列（EP300-1/2、CBP-1/2、LACZ、ch2.2）、嘌呤霉素筛选浓度1 µg/ml及集落形成重复数 阅读提示：Materials and methods“CRISPR-Cas9–based knockout”及Fig. S2 C、D图注 |
| AKT过表达与c-MYC过表达实验 | 质粒ID（pCDH-puro-cMYC #46970、pCDH-puro-myr-HA-AKT1 #46969、pCDH-CMV #72265）、感染时细胞汇合度80%、polybrene 1 µg/ml及筛选浓度 阅读提示：Materials and methods“Stable cell line preparation”及Fig. 2 E–K图注 |
| RNA-seq与ChIP-seq | RNA-seq重复数（OS052/OS525/OS186 n = 3，OS152-EV/myr-AKT n = 2）、JQAD1 1 μM处理24 h、ChIP每份10 μg抗体、差异表达阈值；ChIP-seq启动子定义为TSS ±2 kb 阅读提示：Materials and methods“Spike-in RNA-seq and data analysis”“ChIP-seq analysis”及Fig. 3图注 |
| PRISM联合筛选与MSS计算 | 细胞系数量（MK-2206+JQAD1 n = 871；capivasertib+JQAD1 n = 912）、JQAD1锚定剂量1 μM、处理5天、n = 3重复及MSS公式 阅读提示：Materials and methods“PRISM combination analysis”及Fig. 4 C、D图注 |
| 原位异种移植体内联合给药 | 细胞接种量（OS052 2 × 10^6；OS525 1.5 × 10^6）、小鼠品系与周龄（5周龄雌性NMRI-nu/nu）、JQAD1 20 mg/kg/day腹腔注射、MK-2206 120 mg/kg每周三次口服灌胃、分组样本量及生存终点（肿瘤体积1,600–1,800 mm³） 阅读提示：Materials and methods“In vivo studies”及Fig. 5 A、B图注 |
| 体内IHC检测 | 治疗10天后取材、每组n = 5肿瘤、各抗体稀释度与抗原修复条件 阅读提示：Materials and methods“IHC”及Table 1、Fig. 5 D、Fig. S5 D |