单细胞GWAS平台scHi-HOST感染与测序
在IAV感染下获取单细胞转录组并量化剪接和病毒载量
将96个LCLs混合感染CA09 IAV（MOI 25）或未感染对照，24 hpi收集，10X Genomics Chromium 3'建库，CellRanger比对，Demuxlet分配单细胞，生成伪bulk。
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整合单细胞sQTL定位与深度学习剪接预测鉴定流感感染下的因果变异
Integrating single-cell sQTL mapping with deep-learning splicing prediction identifies causal variants under influenza infection
实验完整度
高包含单细胞GWAS、sQTL定位、深度学习预测、统计精细定位、CRISPR编辑、minigene、Western blot及流式验证
主要模型
96个1000 Genomes淋巴母细胞样细胞系（LCLs） CA09甲型流感病毒感染LCLs CRISPR-Cas9编辑的A549肺上皮细胞克隆D5（纯合A）和B2（纯合G） A549细胞minigene剪接报告系统
重点核对
模型：96个LCLs来自6个1000 Genomes群体，感染CA09 IAV（MOI 25），24 hpi收集 sQTL定位：TensorQTL，FDR<0.05，协变量包括性别、前2个基因型PC和前3个PEER因子 AI预测：SpliceAI和Pangolin delta score≥0.2，并结合SuSiE 95%可信集 实验验证：rs2297616在LCLs、minigene和CRISPR编辑A549中验证剪接和蛋白异构体 IAV burden：EMMAX关联分析，AA基因型与较高病毒载量相关（p=0.029）；编辑细胞流式验证（p=0.0006）
摘要
背景：实现人类遗传学的全部潜力需要识别关联信号背后的因果变异和基因。分子数量性状位点（molQTL）分析，如表达QTL（eQTL）和剪接QTL（sQTL），将遗传变异与中间分子表型联系起来，但精确定位因果变异及其调控效应仍然具有挑战性。在这里，我们将sQTL分析与基于深度学习的剪接效应注释相结合，以识别因果遗传变异并阐明其对人类表型的功能效应。结果：在96个有或无甲型流感病毒（IAV）感染的淋巴母细胞样细胞系中应用单细胞GWAS方法scHi-HOST，我们在感染期间识别出约43,000个与217个基因相关的sQTL SNP-剪接点对。将sQTL定位与基于人工智能的剪接预测和统计精细定位相结合，我们优先确定了57个可能影响顺式作用分子剪接组件的因果变异，包括5'供体和3'受体位点。我们通过实验验证了PARP2基因中的一个此类变异rs2297616，该基因编码聚（ADP-核糖）聚合酶2。该变异改变了PARP2第二内含子的5'剪接供体位点，产生两个相差13个氨基酸的蛋白质异构体。衍生的A等位基因与较长的蛋白质异构体以及淋巴母细胞样细胞系中IAV水平升高相关。CRISPR介导的编辑验证了该变异对蛋白质长度和IAV感染的因果效应。此外，这57个推定的因果sQTL与100多种GWAS性状相关，包括许多与自身免疫性疾病相关的变异。结论：我们的工作提供了一个具有直接剪接影响的因果sQTL目录，为从基因型到疾病易感性提供了因果机制见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何整合sQTL定位与深度学习剪接预测，识别影响剪接的因果遗传变异并阐明其在流感感染中的功能效应？
- 核心机制
- rs2297616的A等位基因在PARP2第二内含子创建新的5'剪接供体位点，产生延长13个氨基酸的蛋白质异构体，该长异构体与IAV病毒载量升高相关。
- 主要证据
- 在96个LCLs中识别43,015个IAV感染相关sQTL SNP-剪接点对；AI和SuSiE精细定位优先确定57个因果变异；rs2297616在LCLs、minigene和CRISPR编辑A549中验证剪接和蛋白长度；AA基因型与IAV载量升高相关并经编辑细胞流式验证。
- 研究意义
- 提供具有直接剪接影响的因果sQTL目录，展示从基因型到疾病易感性的因果机制，并为复杂性状从关联到机制的通用框架提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
差异剪接分析和sQTL定位
识别IAV感染诱导的剪接变化及顺式sQTL
使用Leafcutter计数内含子簇，leafcutter_ds进行差异剪接分析，TensorQTL进行sQTL定位，纳入性别、前2个基因型PC和前3个PEER因子作为协变量。
sQTL分类为rsQTL、csQTL和isQTL
区分IAV响应性、组成型和诱导型sQTL
使用线性混合效应模型（LMM）和似然比检验（LRT）检测基因型×处理交互作用，并辅以z检验比较斜率的差异。
AI剪接预测与统计精细定位整合
从sQTL信号中优先确定因果变异
应用SpliceAI和Pangolin预测剪接影响，采用delta score≥0.2，并使用SuSiE进行精细定位，取95%可信集。
rs2297616功能验证
验证rs2297616对PARP2剪接和蛋白异构体的因果效应
在LCLs中进行Western blot，构建minigene质粒转染A549，使用CRISPR-Cas9编辑A549细胞，扩增cDNA测序和Western blot检测蛋白异构体。
IAV载量关联与CRISPR验证
检验rs2297616对IAV感染的影响
在scHi-HOST数据中用EMMAX关联rs2297616与IAV载量，在CRISPR编辑A549中感染IAV并流式检测感染比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 21870 |
| 热灭活胎牛血清 | Gibco | 10082 | |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030081 | |
| 青霉素G | Gibco | 15140122 | |
| 链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 单细胞RNA-seq建库 | 10x Chromium单细胞3'文库和凝胶珠试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| 免疫印迹 | cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Millipore Sigma | 11836170001 |
| Mini-PROTEAN TGX无染预铸4%-20%凝胶 | Bio-Rad | 4568096 | |
| Immun-Blot低荧光PVDF膜 | Bio-Rad | 1620264 | |
| 抗PARP2多克隆抗体 | Active Motif | AB_2793328 | |
| IRDye 800CW驴抗兔IgG | LI-COR | -- | |
| minigene转染 | pSpliceExpress质粒 | Addgene | 32485 |
| Gateway BP clonase II | Thermo Fisher | -- | |
| 定点突变 | Quikchange II XL定点突变试剂盒 | Agilent | 200521 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher | L3000008 |
| CRISPR编辑 | Alt-R供体寡核苷酸 | IDT | -- |
| DNA提取 | QuickExtract | Bioresearch Technologies | QE0905T |
| PCR | Phusion DNA聚合酶 | New England Biolabs | M0530S |
| RNA提取 | RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| cDNA合成 | iScript | Bio-Rad | -- |
| 凝胶提取 | 凝胶提取试剂盒 | Qiagen | 28706 |
| 流式分析 | Guava Easycyte流式细胞仪 | Guava | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq S4流动池 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| LCLs感染和单细胞RNA-seq | 细胞系来源（96个LCLs，6个1000 Genomes群体）、感染MOI 25、24 hpi收集、未感染对照、单细胞回收数（未感染31,155，IAV 13,794） 阅读提示：Methods中Influenza A virus infections和Single cell RNA-seq library preparation, sequencing, and alignment小节 |
| sQTL定位 | Leafcutter参数（min_clu_reads 30，min_clu_ratio 0.001，max_intron_len 500,000）、TensorQTL协变量（性别、前2个基因型PC、前3个PEER因子）、SNP窗口±100 kb、FDR<0.05 阅读提示：Methods中Identification of splicing QTLs (sQTLs)小节 |
| rsQTL、csQTL和isQTL分类 | LMM模型公式、LRT q-value<0.1、z检验方法、isQTL定义（未感染中未检测或极低表达被过滤） 阅读提示：Methods中IAV response sQTL小节 |
| AI预测和SuSiE精细定位 | SpliceAI和Pangolin delta score阈值≥0.2、SuSiE默认设置（最大10个可信集）、95%可信集定义、PIP≥0.5 阅读提示：Methods中AI-based splicing prediction和Statistical fine mapping with SuSiE小节 |
| rs2297616功能验证 | LCLs基因型（AA: HG00108, HG00507; GG: HG00109, HG00428; GA: HG00113）、minigene构建（pSpliceExpress-A和-G）、CRISPR编辑A549克隆D5和B2、Western blot抗体（anti-PARP2 pAb, Active Motif） 阅读提示：Methods中Immunoblotting, Minigene cloning and transfection, Cas9-RNP editing of A549s, RNA extraction, cDNA synthesis and gel electrophoresis小节；Fig. 5图注 |
| IAV载量关联和CRISPR验证 | EMMAX关联分析（纳入性别协变量， kinship矩阵基于MAF>5%的常染色体SNP）、A549感染MOI 10、24 hpi流式检测GFP+、生物学重复数（3次实验） 阅读提示：Methods中Genetic association for flu burden小节；Fig. 6图注 |