靶向NLRP3/caspase-1/GSDMD治疗迷路出血导致的内耳损伤

Targeting NLRP3/caspase-1/GSDMD to treat inner ear injury from labyrinthine hemorrhage

作者信息Qiong Wu, Mingwei Xu, Yuan Yao, Tianyu Gong, Qin Zhang, Yulian Jin, Jun Yang, Qing Zhang

PMID40583276

期刊Mol Ther

发布时间2025-10-01

DOI10.1016/j.ymthe.2025.06.034

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实验完整度

高

包含IELH小鼠模型、离体耳蜗外植体、免疫荧光、Western blot、qPCR、行为学及ABR等多层级功能与机制验证

主要模型

C57BL/6小鼠IELH模型（经圆窗膜注射自体尾静脉血） P3 C57BL/6小鼠耳蜗外植体（基底膜培养） C57BL/6小鼠离体耳蜗基底膜（LPS/nigericin刺激） C57BL/6小鼠前庭组织（椭圆囊、球囊、壶腹嵴）

重点核对

IELH模型制作：圆窗膜注射4 μL自体尾静脉血，Sham组注射4 μL生理盐水 CY-09给药：IELH后经圆窗膜注射2 μL CY-09（终浓度10 μM），侧卧位10 min 分组设计：Sham、CY-09、IELH、CY-09+IELH四组检测时间点：IELH后1、3、7天（行为学及免疫荧光主要选3天）检测指标：ABR阈值、前庭行为学评分、毛细胞计数、NLRP3/caspase-1/IL-1β/GSDMD表达、LDH释放

摘要

突发性感音神经性听力损失（SSNHL）是耳鼻咽喉科的一种常见疾病，其机制尚不清楚。内耳迷路出血（IELH）是一个可能的重要原因。我们的研究聚焦于IELH后NLR家族 pyrin 结构域包含3（NLRP3）炎症小体的激活以及NLRP3抑制剂CY-09的保护作用。在IELH小鼠中，与对照组相比，观察到听力阈值显著升高和前庭功能障碍。NLRP3炎症小体及其他促炎因子的激活显著升高，通过Gasdermin D（GSDMD）介导的细胞焦亡途径导致耳蜗和前庭毛细胞的潜在损伤。CY-09治疗通过抑制NLRP3炎症小体及相关细胞焦亡，显著改善了听力损失和前庭功能障碍。这些结果突出了NLRP3炎症小体和细胞焦亡在IELH诱导的SSNHL中的关键作用，并提示NLRP3/caspase-1/GSDMD通路是治疗该疾病的治疗靶点。本研究为SSNHL的潜在临床管理提供了新的理论依据。

IELH小鼠模型建立与听功能评估

验证IELH是否导致听力损失及耳蜗毛细胞损伤

经圆窗膜注射自体尾静脉血建立IELH模型，进行ABR检测和免疫荧光染色观察耳蜗毛细胞

前庭功能与形态评估

验证IELH是否导致前庭功能障碍及前庭毛细胞损伤

进行平衡木、游泳、转棒和旷场行为学测试，免疫荧光染色观察椭圆囊、球囊和壶腹嵴毛细胞

NLRP3/caspase-1/GSDMD通路激活验证

验证IELH是否激活NLRP3炎症小体及焦亡通路

免疫荧光、Western blot和qPCR检测NLRP3、caspase-1、IL-1β、GSDMD表达，LDH释放检测

CY-09体外剂量验证

确定CY-09抑制NLRP3炎症小体的有效浓度

耳蜗外植体经LPS和nigericin刺激后，用0-20 μM CY-09处理，Western blot和ELISA检测

CY-09体内保护效果评估

验证CY-09是否改善IELH诱导的听力和前庭功能障碍及毛细胞损伤

IELH后经圆窗膜注射CY-09，3天后进行免疫荧光、Western blot、qPCR、ABR和行为学检测

实验环节	名称	品牌	货号
IELH模型建立	玻璃微量移液管	Drummond	5-000-1001-X10
组织粘合剂	3M Vetbond	1469SB
耳蜗外植体培养	细胞粘附剂	Corning	354240
B-27添加剂	Gibco	17504044
N-2添加剂	Gibco	A1370701
ELISA	IL-1β酶联免疫吸附试剂盒	Neobioscience Technology	EMC001b
LDH检测	乳酸脱氢酶检测试剂盒	Beyotime	C0019S
H&E染色	H&E染色试剂盒	Beyotime	C0105S
免疫荧光	ProLong玻璃抗淬灭封片剂	Invitrogen	--
Western blot	RIPA裂解液	Epizyme	PC101
蛋白酶抑制剂混合物	Epizyme	GRF101
磷酸酶抑制剂混合物	Epizyme	GRF101
Omni-ECL Femto超敏化学发光试剂盒	Epizyme	SQ201
免疫荧光	抗肌球蛋白7a兔抗体	Proteus Bioscience	25-6790
人/小鼠/大鼠Sox2抗体	R&D	AF2018
鬼笔环肽	Yeasen	40774ES
DAPI	Abcam	ab104139
Western blot/免疫荧光	抗NLRP3抗体	Abcam	ab270449
抗IL-1β抗体	Abcam	ab254360
抗caspase-1抗体	Merck Millipore	AB1871
抗GSDMD抗体	Arigo Biolaboratories	ARG41404
Western blot	抗GAPDH抗体	Cell Signaling Technology	5174
β-actin多克隆抗体	Bioss	bs-0061R
免疫荧光	驴抗兔Alexa Fluor Plus 488荧光二抗	ThermoFisher	A32790
驴抗山羊Alexa Fluor Plus 647荧光二抗	ThermoFisher	A32849
驴抗小鼠Alexa Fluor Plus 594荧光二抗	ThermoFisher	A21203
NLRP3抑制	CY-09	Medchem Express	HY-103666

实验环节

名称

品牌

货号

IELH模型建立

玻璃微量移液管

Drummond

5-000-1001-X10

组织粘合剂

3M Vetbond

1469SB

耳蜗外植体培养

细胞粘附剂

Corning

354240

B-27添加剂

Gibco

17504044

N-2添加剂

Gibco

A1370701

ELISA

IL-1β酶联免疫吸附试剂盒

Neobioscience Technology

EMC001b

LDH检测

乳酸脱氢酶检测试剂盒

Beyotime

C0019S

H&E染色

H&E染色试剂盒

Beyotime

C0105S

免疫荧光

ProLong玻璃抗淬灭封片剂

Invitrogen

Western blot

RIPA裂解液

Epizyme

PC101

蛋白酶抑制剂混合物

Epizyme

GRF101

磷酸酶抑制剂混合物

Epizyme

GRF101

Omni-ECL Femto超敏化学发光试剂盒

Epizyme

SQ201

免疫荧光

抗肌球蛋白7a兔抗体

Proteus Bioscience

25-6790

人/小鼠/大鼠Sox2抗体

R&D

AF2018

鬼笔环肽

Yeasen

40774ES

DAPI

Abcam

ab104139

Western blot/免疫荧光

抗NLRP3抗体

Abcam

ab270449

抗IL-1β抗体

Abcam

ab254360

抗caspase-1抗体

Merck Millipore

AB1871

抗GSDMD抗体

Arigo Biolaboratories

ARG41404

Western blot

抗GAPDH抗体

Cell Signaling Technology

5174

β-actin多克隆抗体

Bioss

bs-0061R

免疫荧光

驴抗兔Alexa Fluor Plus 488荧光二抗

ThermoFisher

A32790

驴抗山羊Alexa Fluor Plus 647荧光二抗

ThermoFisher

A32849

驴抗小鼠Alexa Fluor Plus 594荧光二抗

ThermoFisher

A21203

NLRP3抑制

CY-09

Medchem Express

HY-103666

环节	核对要点
IELH模型建立	小鼠品系、年龄、性别；注射血液体积（4 μL）；注射部位（圆窗膜）；Sham组注射生理盐水体积（4 μL）阅读提示：Methods中IELH model小节
CY-09给药	CY-09终浓度（10 μM）；注射体积（2 μL）；注射时机（IELH后）；侧卧位时间（10 min）；载体（生理盐水）阅读提示：Methods中IELH model小节及Results中CY-09相关段落
耳蜗外植体培养与处理	小鼠年龄（P3）；培养基成分（97% DMEM, 2% B-27, 1% N-2, 0.1% ampicillin）；LPS浓度（1 μg/mL）及时间（4 h）；nigericin浓度（10 μM）及时间（4 h）；CY-09预处理浓度（10 μM）及时间（1 h）阅读提示：Methods中Cochlear explant culture and treatment小节
ABR检测	刺激声类型（click和tone burst）；频率（4, 8, 11, 16, 32 kHz）；初始声强（90 dB SPL）；递减步长（5 dB）；麻醉剂及剂量（Zoletil50 45 mg/kg，xylazine 5 mg/kg）阅读提示：Methods中Auditory brainstem responses小节
行为学测试	旷场实验场地尺寸（50×50×40 cm）及测试时间（15 min）；转棒实验加速范围（4-60 rpm）及最大时间（300 s）；游泳实验水温（20°C-22°C）及时间（1 min）；平衡木测试跌落计时（60 s）阅读提示：Methods中Open field test、Rotarod test、Swimming test、Balance beam test小节
免疫荧光与Western blot	一抗稀释比例；二抗稀释比例；DAPI和phalloidin染色条件；Western blot蛋白上样量、凝胶浓度（12% SDS-PAGE）、转膜条件阅读提示：Methods中Immunofluorescence staining、Western blot、Antibodies and reagents小节
qPCR	引物序列（Table 1）；内参基因（GAPDH）；反应体系及条件；重复次数（三次）阅读提示：Methods中qPCR小节及Table 1
统计分析	样本量（n=3-6）；数据表示（mean ± SD）；显著性阈值（p < 0.05）；统计方法（t检验、单因素方差分析、Dunnett多重比较）阅读提示：Methods中Statistical analysis小节及Figure legends

环节

核对要点

IELH模型建立

小鼠品系、年龄、性别；注射血液体积（4 μL）；注射部位（圆窗膜）；Sham组注射生理盐水体积（4 μL）

阅读提示：Methods中IELH model小节

CY-09给药

CY-09终浓度（10 μM）；注射体积（2 μL）；注射时机（IELH后）；侧卧位时间（10 min）；载体（生理盐水）

阅读提示：Methods中IELH model小节及Results中CY-09相关段落

耳蜗外植体培养与处理

小鼠年龄（P3）；培养基成分（97% DMEM, 2% B-27, 1% N-2, 0.1% ampicillin）；LPS浓度（1 μg/mL）及时间（4 h）；nigericin浓度（10 μM）及时间（4 h）；CY-09预处理浓度（10 μM）及时间（1 h）

阅读提示：Methods中Cochlear explant culture and treatment小节

ABR检测

刺激声类型（click和tone burst）；频率（4, 8, 11, 16, 32 kHz）；初始声强（90 dB SPL）；递减步长（5 dB）；麻醉剂及剂量（Zoletil50 45 mg/kg，xylazine 5 mg/kg）

阅读提示：Methods中Auditory brainstem responses小节

行为学测试

旷场实验场地尺寸（50×50×40 cm）及测试时间（15 min）；转棒实验加速范围（4-60 rpm）及最大时间（300 s）；游泳实验水温（20°C-22°C）及时间（1 min）；平衡木测试跌落计时（60 s）

阅读提示：Methods中Open field test、Rotarod test、Swimming test、Balance beam test小节

免疫荧光与Western blot

一抗稀释比例；二抗稀释比例；DAPI和phalloidin染色条件；Western blot蛋白上样量、凝胶浓度（12% SDS-PAGE）、转膜条件

阅读提示：Methods中Immunofluorescence staining、Western blot、Antibodies and reagents小节

qPCR

引物序列（Table 1）；内参基因（GAPDH）；反应体系及条件；重复次数（三次）

阅读提示：Methods中qPCR小节及Table 1

统计分析

样本量（n=3-6）；数据表示（mean ± SD）；显著性阈值（p < 0.05）；统计方法（t检验、单因素方差分析、Dunnett多重比较）

阅读提示：Methods中Statistical analysis小节及Figure legends

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