TMEM59以TREM2依赖性方式调控小胶质细胞Aβ吞噬并作为Aβ淀粉样变的潜在治疗靶点

TMEM59 regulates microglial Aβ phagocytosis in a TREM2-dependent manner and acts as a potential therapeutic target for Aβ amyloidosis

作者信息Jian Meng, Yong Wang, Jinghui Wang, Yiqing Chen, Zihao Zhao, Ziqian Tang, Jing Cao, Xian Zhang, Hong Luo, Huihui Li, Yili Wu, Yingjun Zhao, Weihong Song, Yun-Wu Zhang

PMID42786742

期刊Alzheimers Dement

发布时间2026-09

DOI10.1002/alz.71873

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实验完整度

高

包含5xFAD;cKO及cKO;Trem2−/−小鼠在体模型、原代小胶质细胞体外吞噬实验、scRNA-seq与CMATAC干预验证，含功能与机制验证。

主要模型

5xFAD小鼠及微胶质细胞特异性Tmem59敲除（5xFAD;cKO）小鼠原代小胶质细胞 HEK293T细胞 cKO;Trem2−/−小鼠

重点核对

5xFAD;cKO小鼠在7月龄进行Y迷宫、恐惧条件反射和Morris水迷宫行为学检测，n=22 Ctrl、21 cKO、22 5xFAD、20 5xFAD;cKO 7月龄5xFAD与5xFAD;cKO小鼠海马和皮层ThioS及6E10斑块面积定量，n=10只/组原代小胶质细胞与FAM标记Aβ1–42寡聚体孵育1 h后流式检测吞噬，n=5独立实验 7月龄5xFAD与5xFAD;cKO小鼠腹腔注射methoxy-X04（10 mg/kg）3 h后流式检测小胶质细胞Aβ吞噬，n=5只/组 CMATAC或对照肽以5 mg/kg尾静脉注射，隔日一次共20天，随后行为学检测10天，n=12 WT-Control、11 5xFAD-Control、11 5xFAD-CMATAC

摘要

引言：小胶质细胞介导的淀粉样蛋白β（Aβ）清除对缓解阿尔茨海默病（AD）进展至关重要，但小胶质细胞吞噬作用的分子调控因子仍未被完全理解。方法：我们评估了微胶质细胞特异性敲除跨膜蛋白59（TMEM59）的5xFAD小鼠的AD相关表型。使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行小胶质细胞转录组分析。开发了一种伴侣介导的自噬靶向嵌合体（CMATAC）肽来降解TMEM59，并评估了其治疗效果。结果：微胶质细胞特异性TMEM59敲除减轻了5xFAD小鼠的认知缺陷、Aβ斑块负荷和突触丢失。TMEM59缺失将疾病相关小胶质细胞重编程为高度吞噬状态。机制上，TMEM59缺失以髓样细胞触发受体2（TREM2）依赖性方式增强小胶质细胞Aβ吞噬，因为它稳定了TREM2蛋白，而TREM2缺失消除了这些保护作用。用TMEM59降解CMATAC肽治疗减轻了5xFAD小鼠的行为缺陷并增强了小胶质细胞Aβ吞噬。讨论：TMEM59是AD中小胶质细胞吞噬的关键调节因子，也是淀粉样变干预的新靶点。

构建微胶质细胞特异性TMEM59敲除AD小鼠模型

验证微胶质细胞TMEM59缺失是否影响5xFAD小鼠AD相关表型。

将Tmem59flox/flox;Lyz2Cre/+（cKO）小鼠与5xFAD或Trem2−/−小鼠杂交，生成5xFAD;cKO或cKO;Trem2−/−小鼠，并在7月龄进行行为学与病理分析。

评估TMEM59缺失对认知功能和Aβ病理的影响

验证微胶质细胞TMEM59缺失是否缓解5xFAD小鼠认知缺陷、Aβ斑块和突触丢失。

在7月龄小鼠中进行Y迷宫、恐惧条件反射、Morris水迷宫，以及ThioS、6E10免疫染色和SynI/PSD-95共定位分析。

scRNA-seq解析小胶质细胞状态重编程

解析TMEM59缺失如何影响AD病理下小胶质细胞转录状态和DAM亚群。

取7月龄WT、5xFAD和5xFAD;cKO小鼠皮层和海马混合样本进行scRNA-seq，聚类并分析DAM亚群及KEGG通路。

验证TMEM59缺失对小胶质细胞Aβ吞噬和聚集的影响

验证TMEM59缺失是否增强小胶质细胞在斑块周围聚集和Aβ吞噬能力。

免疫荧光检测Iba1、6E10、CLEC7A、CD68共定位和3D重建；腹腔注射methoxy-X04后流式检测小胶质细胞Aβ吞噬；原代小胶质细胞与FAM-Aβ1–42寡聚体孵育后流式检测。

验证TREM2在TMEM59调控Aβ吞噬中的依赖性

验证TMEM59缺失增强Aβ吞噬是否依赖TREM2，以及是否通过稳定TREM2蛋白实现。

检测斑块周围小胶质细胞TREM2表达、Trem2 mRNA水平、HEK293T中TMEM59敲低后TREM2蛋白水平和CHX降解实验；在cKO;Trem2−/−原代小胶质细胞和FAM-Aβ1–42海马注射模型中检测吞噬。

构建并验证TMEM59靶向CMATAC降解肽

开发可选择性降解TMEM59的CMATAC肽并验证其结合、入脑和降解效果。

基于ATG16L1 WD7 D3片段、GSGS linker、CMA靶向基序、TAT细胞穿膜肽和FITC标签设计CMATAC肽，对照肽缺少CTM；用MST检测结合，尾静脉注射检测BBB通透性，免疫荧光检测细胞摄取。

评估CMATAC肽在5xFAD小鼠中的疗效和安全性

验证CMATAC降解TMEM59是否减轻5xFAD小鼠行为缺陷、Aβ病理并增强小胶质细胞吞噬。

6月龄WT或5xFAD小鼠隔日尾静脉注射5 mg/kg CMATAC或对照肽20天，继续给药10天进行行为学检测；随后检测TMEM59蛋白、ThioS/6E10斑块、SynI/PSD-95、Iba1/CLEC7A/TREM2/CD68及H&E毒性。

实验环节	名称	品牌	货号
原代小胶质细胞培养	多聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	26124-78-7
DMEM培养基	Gibco	11965092
热灭活胎牛血清	ExCell	FSP500
粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子	R&D Systems	415-ML
海马注射Aβ寡聚体	FAM标记的Aβ1–42	AnaSpec	AS-23526-01
Fluor 555标记的Aβ1–42	AnaSpec	AS-60480-01
立体定位手术与AAV标记	AAV2/9-hSyn-FLP-WPRE-pA	BrainVTA	PT-0341
AAV2/9-nEF1a-FDIO-EYFP-EYFP-WPRE-pA	BrainVTA	PT-1210
免疫荧光染色	抗Iba1抗体	Cell Signaling Technology	17198S
抗CD68抗体	Biolegend	137001
抗6E10抗体	Biolegend	803014
抗CLEC7A抗体	InvivoGen	mabg-mdect
抗TREM2抗体	R&D Systems	AF1729
抗PSD-95抗体	Millipore	MAB1596
抗Synapsin I抗体	Proteintech	20258-1-AP
荧光标记二抗	Invitrogen	A11005, A11008, A21247, A21448
H&E染色	H&E染色试剂盒	Solarbio	G1121
在体多光子成像	Texas Red标记的葡聚糖（70 kDa）	Thermo Fisher Scientific	D1830
流式吞噬实验	methoxy-X04	Tocris	4920
Percoll分离液	Cytiva	17089102
抗CD16/32抗体	Biolegend	101301
抗CD11b-APC抗体	eBioscience	17-0112-82
抗CD45-FITC抗体	eBioscience	11-0451-85
转染	脂质体2000转染试剂	Yeasen	40802ES03
Lipofectamine 2000试剂	Thermo Fisher Scientific	11668019
Co-IP	IP裂解缓冲液	Beyotime Biotechnology	P0037
蛋白酶抑制剂混合物	MedChemExpress	HY-K0010
Protein A/G磁珠	MedChemExpress	HY-K0202
Western blot	磷酸酶抑制剂混合物	TargetMol	C0002, C0003
BCA蛋白定量试剂盒	Thermo Fisher Scientific	23225
抗TREM2抗体	CST	91068S
抗TMEM59抗体	ABclonal	WG-03224D
抗GFP抗体	Proteintech	50430-2-AP
抗myc抗体	CST	2276S
抗myc抗体	CST	2278S
抗HA抗体	Abmart	M20003L
抗β-actin抗体	CST	8457S
抗α-tubulin抗体	Millipore	MABT205
山羊抗小鼠IgG	LABLEAD	S0100
山羊抗兔IgG	LABLEAD	S0101
Aβ ELISA	人Aβ40 ELISA试剂盒	Thermo Fisher Scientific	KHB3481
人Aβ42 ELISA试剂盒	Thermo Fisher Scientific	KHB3441
RNA提取与qRT-PCR	TRIzol试剂	Invitrogen	15596018CN
HiScript II Q RT SuperMix	Vazyme	R222-01
Taq Pro通用SYBR qPCR预混液	Vazyme	Q712-03
微量热泳动	His标签重组TMEM59蛋白	IPODIX Biotechnology	PA2000-1829
RED-tris-NTA荧光染料	NanoTemper Technologies	MO-L018

实验环节

名称

品牌

货号

原代小胶质细胞培养

多聚-L-赖氨酸

Sigma-Aldrich

26124-78-7

DMEM培养基

Gibco

11965092

热灭活胎牛血清

ExCell

FSP500

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

R&D Systems

415-ML

海马注射Aβ寡聚体

FAM标记的Aβ1–42

AnaSpec

AS-23526-01

Fluor 555标记的Aβ1–42

AnaSpec

AS-60480-01

立体定位手术与AAV标记

AAV2/9-hSyn-FLP-WPRE-pA

BrainVTA

PT-0341

AAV2/9-nEF1a-FDIO-EYFP-EYFP-WPRE-pA

BrainVTA

PT-1210

免疫荧光染色

抗Iba1抗体

Cell Signaling Technology

17198S

抗CD68抗体

Biolegend

137001

抗6E10抗体

Biolegend

803014

抗CLEC7A抗体

InvivoGen

mabg-mdect

抗TREM2抗体

R&D Systems

AF1729

抗PSD-95抗体

Millipore

MAB1596

抗Synapsin I抗体

Proteintech

20258-1-AP

荧光标记二抗

Invitrogen

A11005, A11008, A21247, A21448

H&E染色

H&E染色试剂盒

Solarbio

G1121

在体多光子成像

Texas Red标记的葡聚糖（70 kDa）

Thermo Fisher Scientific

D1830

流式吞噬实验

methoxy-X04

Tocris

4920

Percoll分离液

Cytiva

17089102

抗CD16/32抗体

Biolegend

101301

抗CD11b-APC抗体

eBioscience

17-0112-82

抗CD45-FITC抗体

eBioscience

11-0451-85

转染

脂质体2000转染试剂

Yeasen

40802ES03

Lipofectamine 2000试剂

Thermo Fisher Scientific

11668019

Co-IP

IP裂解缓冲液

Beyotime Biotechnology

P0037

蛋白酶抑制剂混合物

MedChemExpress

HY-K0010

Protein A/G磁珠

MedChemExpress

HY-K0202

Western blot

磷酸酶抑制剂混合物

TargetMol

C0002, C0003

BCA蛋白定量试剂盒

Thermo Fisher Scientific

23225

抗TREM2抗体

CST

91068S

抗TMEM59抗体

ABclonal

WG-03224D

抗GFP抗体

Proteintech

50430-2-AP

抗myc抗体

CST

2276S

抗myc抗体

CST

2278S

抗HA抗体

Abmart

M20003L

抗β-actin抗体

CST

8457S

抗α-tubulin抗体

Millipore

MABT205

山羊抗小鼠IgG

LABLEAD

S0100

山羊抗兔IgG

LABLEAD

S0101

Aβ ELISA

人Aβ40 ELISA试剂盒

Thermo Fisher Scientific

KHB3481

人Aβ42 ELISA试剂盒

Thermo Fisher Scientific

KHB3441

RNA提取与qRT-PCR

TRIzol试剂

Invitrogen

15596018CN

HiScript II Q RT SuperMix

Vazyme

R222-01

Taq Pro通用SYBR qPCR预混液

Vazyme

Q712-03

微量热泳动

His标签重组TMEM59蛋白

IPODIX Biotechnology

PA2000-1829

RED-tris-NTA荧光染料

NanoTemper Technologies

MO-L018

环节	核对要点
动物模型构建与行为学	5xFAD（stock 008730）、Trem2−/−（stock 027197）、cKO小鼠品系来源；7月龄行为学时间点；行为学n=22 Ctrl、21 cKO、22 5xFAD、20 5xFAD;cKO；行为学同时使用雄性和雌性，其他分析使用雄性样本。阅读提示：Methods 2.1 Animals；Figure 1A；Figure 1 legend
Aβ斑块与突触病理检测	ThioS和6E10染色方法；7月龄5xFAD和5xFAD;cKO小鼠；海马与皮层定量；n=10只/组斑块定量；SynI/PSD-95共定位方法及样本量：文中未明确说明。阅读提示：Methods 2.8 Thioflavin S staining；Methods 2.7 Immunofluorescence staining；Figure 1J–O；Figure S3E–H
小胶质细胞Aβ吞噬检测	methoxy-X04剂量10 mg/kg，腹腔注射，1:9 DMSO/PBS（pH 12.0），3 h后取材；原代小胶质细胞与FAM标记Aβ1–42寡聚体孵育1 h；流式抗体CD11b-APC和CD45-FITC；体内n=5只/组，体外n=5独立实验。阅读提示：Methods 2.12 Engulfment assays by flow cytometry；Figure 3G–J
TREM2依赖性验证	HEK293T转染TREM2-myc与TMEM59 siRNA或NC；CHX浓度100 µM及处理时间点；原代小胶质细胞来源Ctrl、cKO、cKO;Trem2−/−；海马注射FAM-Aβ1–42寡聚体1.5 µg/3 µL，16 h后取材；n=5独立实验或5只/组。阅读提示：Methods 2.13 Transfection；Methods 2.5 Stereotaxic surgery；Figure 4D–K
CMATAC肽设计与给药	CMATAC肽序列组成：D3 PBD、GSGS linker、CTM、TAT CPP、FITC；对照肽缺少CTM；MST测得Kd 2.64 ± 0.33 µM；6月龄WT和5xFAD小鼠，5 mg/kg尾静脉注射，隔日一次共20天，随后行为学10天；n=12 WT-Control、11 5xFAD-Control、11 5xFAD-CMATAC。阅读提示：Methods 2.3 Intravenous injection；Methods 2.18 Microscale thermophoresis；Figure 5E–H；Figure 6A
CMATAC疗效与安全性检测	行为学后取材检测TMEM59蛋白、ThioS/6E10斑块、SynI/PSD-95、Iba1/CLEC7A/TREM2/CD68；斑块定量n=5只/组；H&E检测心、肝、脾、肺、肾；外周免疫影响未评估：文中未明确说明。阅读提示：Figure 6B–O；Figure 7A–H；Figure S7G；Discussion limitations

环节

核对要点

动物模型构建与行为学

5xFAD（stock 008730）、Trem2−/−（stock 027197）、cKO小鼠品系来源；7月龄行为学时间点；行为学n=22 Ctrl、21 cKO、22 5xFAD、20 5xFAD;cKO；行为学同时使用雄性和雌性，其他分析使用雄性样本。

阅读提示：Methods 2.1 Animals；Figure 1A；Figure 1 legend

Aβ斑块与突触病理检测

ThioS和6E10染色方法；7月龄5xFAD和5xFAD;cKO小鼠；海马与皮层定量；n=10只/组斑块定量；SynI/PSD-95共定位方法及样本量：文中未明确说明。

阅读提示：Methods 2.8 Thioflavin S staining；Methods 2.7 Immunofluorescence staining；Figure 1J–O；Figure S3E–H

小胶质细胞Aβ吞噬检测

methoxy-X04剂量10 mg/kg，腹腔注射，1:9 DMSO/PBS（pH 12.0），3 h后取材；原代小胶质细胞与FAM标记Aβ1–42寡聚体孵育1 h；流式抗体CD11b-APC和CD45-FITC；体内n=5只/组，体外n=5独立实验。

阅读提示：Methods 2.12 Engulfment assays by flow cytometry；Figure 3G–J

TREM2依赖性验证

HEK293T转染TREM2-myc与TMEM59 siRNA或NC；CHX浓度100 µM及处理时间点；原代小胶质细胞来源Ctrl、cKO、cKO;Trem2−/−；海马注射FAM-Aβ1–42寡聚体1.5 µg/3 µL，16 h后取材；n=5独立实验或5只/组。

阅读提示：Methods 2.13 Transfection；Methods 2.5 Stereotaxic surgery；Figure 4D–K

CMATAC肽设计与给药

CMATAC肽序列组成：D3 PBD、GSGS linker、CTM、TAT CPP、FITC；对照肽缺少CTM；MST测得Kd 2.64 ± 0.33 µM；6月龄WT和5xFAD小鼠，5 mg/kg尾静脉注射，隔日一次共20天，随后行为学10天；n=12 WT-Control、11 5xFAD-Control、11 5xFAD-CMATAC。

阅读提示：Methods 2.3 Intravenous injection；Methods 2.18 Microscale thermophoresis；Figure 5E–H；Figure 6A

CMATAC疗效与安全性检测

行为学后取材检测TMEM59蛋白、ThioS/6E10斑块、SynI/PSD-95、Iba1/CLEC7A/TREM2/CD68；斑块定量n=5只/组；H&E检测心、肝、脾、肺、肾；外周免疫影响未评估：文中未明确说明。

阅读提示：Figure 6B–O；Figure 7A–H；Figure S7G；Discussion limitations

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