单克隆抗体的筛选与亲和力评价
确定QMAb-1和QMAb-2与galectin-3的结合能力，并确认chelator偶联后不损害结合能力。
通过ELISA和BLI测定QMAb-1、QMAb-2及其DFO/DTPA偶联物与人galectin-3的结合亲和力。
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开发用于癌症诊疗的靶向半乳糖凝集素-3的放射免疫配体
Development of galectin-3 targeted radioimmunoligands for cancer theranostics
实验完整度
高包含体外细胞摄取、ELISA/BLI亲和力、小鼠PET/CT成像、离体生物分布及177Lu治疗效果与毒性验证等多个独立证据层级。
主要模型
4T-1小鼠三阴性乳腺癌细胞系及同种移植瘤模型 MCF-7人乳腺癌细胞系及异种移植瘤模型 HCT-116人结直肠癌细胞系及异种移植瘤模型 HT-29人结直肠癌细胞系及异种移植瘤模型
重点核对
QMAb-1和QMAb-2与chelator偶联后与人galectin-3的结合亲和力经ELISA和BLI验证 [89Zr]Zr-DFO-QMAb-1和[89Zr]Zr-DFO-QMAb-2在4T-1、MCF-7、HCT-116和HT-29肿瘤模型中的PET/CT成像及ROI分析 [177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1和[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-2在4T-1荷瘤小鼠中的治疗效果、生存期和毒性评价 阻断实验：注射[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1后立即给予0.5 mg抗galectin-3抗体 离体生物分布：注射0.74 MBq放射免疫配体后检测肿瘤和主要器官的%ID/g
摘要
半乳糖凝集素-3与多种难治性癌症的侵袭性、增殖和转移相关。尽管靶向半乳糖凝集素-3的正电子发射断层扫描（PET）示踪剂在癌症诊断中显示出相当大的前景，但针对难治性或不可治疗恶性肿瘤的半乳糖凝集素-3导向的放射性药物治疗的治疗潜力仍很大程度上未得到探索。本研究旨在开发新型靶向半乳糖凝集素-3的放射免疫配体，并在多种肿瘤模型中验证其放射诊疗潜力。两种新型靶向半乳糖凝集素-3的单克隆抗体（QMAb-1和QMAb-2）分别用89Zr和177Lu标记。[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1和[89Zr]Zr-DFO-QMAb-2的PET/CT成像在具有不同半乳糖凝集素-3表达水平的小鼠肿瘤模型中进行评估。此外，还研究了[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1和[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-2的治疗效果。观察到[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1具有优越的肿瘤摄取和滞留时间。值得注意的是，[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1表现出最小的脱靶积累以及从血液和主要器官中的快速清除。此外，[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1显示出强效抗肿瘤效果，且未诱导血液毒性及主要器官损伤，突显了其治疗潜力和安全性。本研究通过利用高亲和力mAbs作为配体，扩展了半乳糖凝集素-3放射性药物工具箱，为半乳糖凝集素-3阳性癌症的诊断和治疗提供了一种新方式。此外，[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1和[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1诊疗对在三阴性乳腺癌模型中的良好表现进一步支持了其在多种难治性恶性肿瘤中的临床应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发新型靶向半乳糖凝集素-3的放射免疫配体，并验证其在多种肿瘤模型中的放射诊疗潜力。
- 核心机制
- 放射免疫配体通过单克隆抗体QMAb-1特异性结合肿瘤galectin-3，实现PET/CT成像和放射性药物治疗。
- 主要证据
- 在4T-1、MCF-7、HCT-116和HT-29肿瘤模型中进行的PET/CT成像和离体生物分布显示[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1的肿瘤摄取和滞留时间优于[89Zr]Zr-DFO-QMAb-2；[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1在4T-1荷瘤小鼠中显示抗肿瘤效果和可接受的安全性。
- 研究意义
- 扩展了半乳糖凝集素-3放射性药物工具箱，特别是RPT，并支持其在三阴性乳腺癌等难治性恶性肿瘤中的临床应用潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
放射免疫配体的合成与质量控制
制备89Zr和177Lu标记的放射免疫配体并评估其放射化学性质和稳定性。
DFO-QMAb-1/2与89Zr偶联，DTPA-QMAb-1/2与177Lu偶联，经Radio-TLC测定放射化学纯度，并在PBS和FBS中评估72和168小时稳定性。
galectin-3表达水平检测
评估不同肿瘤细胞系中galectin-3的表达水平。
通过qPCR、Western blot和免疫荧光染色检测4T-1、MCF-7、HCT-116和HT-29细胞及肿瘤组织中galectin-3表达。
体外细胞摄取评价
评估[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1和[89Zr]Zr-DFO-QMAb-2在4T-1和MCF-7细胞中的摄取能力。
将放射免疫配体加入细胞，孵育不同时间后洗涤并测定放射性。
PET/CT成像与体内特异性验证
评估[89Zr]Zr-DFO-QMAb-1和[89Zr]Zr-DFO-QMAb-2在肿瘤模型中的摄取、特异性和药代动力学。
在4T-1、MCF-7、HCT-116和HT-29荷瘤小鼠中进行PET/CT成像，并进行阻断实验和mIgG对照。
离体生物分布评价
验证PET/CT结果并获取放射免疫配体的详细药代动力学信息。
在4T-1荷瘤小鼠和正常小鼠中注射放射免疫配体，不同时间点处死并测定肿瘤和主要器官放射性。
治疗效果与体内毒性评价
评估[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1和[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-2在4T-1荷瘤小鼠中的抗肿瘤效果和安全性。
单次注射放射免疫配体，监测肿瘤体积、体重和生存期，终点进行血液学、肝肾功能和H&E染色分析。
QMAb-1和QMAb-2急性毒性评价
评估未标记QMAb-1和QMAb-2的体内毒性。
BALB/c小鼠单次注射QMAb-1或QMAb-2，10天后分析血液学、肝肾功能和主要器官H&E染色。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体偶联 | p-SCN-Bn-DFO | MedChemExpress | HY-134797 |
| Bz-DTPA | MedChemExpress | HY-156035 | |
| 放射性标记 | 锆-89 | DC AMS Pharm | -- |
| 镥-177 | DC AMS Pharm | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11872093 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 胎牛血清 | Vistech | SE100-011 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15240062 | |
| ELISA | 人半乳糖凝集素-3蛋白 | ACRO Biosystems | GA3-H5129 |
| HRP偶联山羊抗小鼠IgG | Abcam | ab97040 | |
| 总RNA提取 | RNA Easy Fast组织/细胞试剂盒 | Tiangen | DP451 |
| 逆转录 | NovoScript®Plus All-in-one第一链cDNA合成预混液 | Novaprotein | E047-01A |
| qPCR | NovoStart® Universal Fast SYBR qPCR预混液 | Novoprotein | E401 |
| Western blot | RIPA细胞裂解缓冲液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | P0009 | |
| 抗半乳糖凝集素-3抗体 | Proteintech | 60207-1-Ig | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC038 | |
| 山羊抗小鼠二抗 | ABclonal | WX444956 | |
| 山羊抗兔二抗 | ABclonal | WX272267 | |
| 免疫荧光染色 | Alexa Fluor 488偶联二抗 | -- | ab150113 |
| DAPI | Sigma–Aldrich | D9542-5 MG |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体偶联与放射性标记 | QMAb-1/QMAb-2浓度2 mg/mL，1 mL/反应；p-SCN-Bn-DFO或Bz-DTPA浓度20 mg/mL，0.02 mL/反应；偶联条件37 °C，500 rpm，60 min；89Zr标记pH 7.0–8.4；177Lu标记pH 4.0–5.5 阅读提示：Methods 2.2和2.10小节 |
| PET/CT成像 | 注射剂量1.48 MBq in 0.1 mL saline，尾静脉注射；成像时间点4、24、96、144、168 h p.i.；阻断实验抗galectin-3抗体剂量0.5 mg；n = 3 阅读提示：Methods 2.11小节及Figure 3、4、5图注 |
| 离体生物分布 | 注射剂量0.74 MBq in 0.1 mL saline，尾静脉注射；时间点24、96、168 h p.i.；n = 3 阅读提示：Methods 2.12小节及Figure 6图注 |
| 治疗效果评价 | 单次剂量14.8 MBq in 0.1 mL saline，尾静脉注射；肿瘤体积至少100–200 mm3；n = 6；每两天测量肿瘤体积和体重；终点时间：saline Day 26 p.i.，[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-1 Day 28 p.i.，[177Lu]Lu-DTPA-QMAb-2 Day 14 p.i. 阅读提示：Methods 2.13小节及Figure 7图注 |
| 急性毒性评价 | QMAb-1或QMAb-2单次注射总量200 μg；n = 6；10天后分析血液学、肝肾功能和H&E染色 阅读提示：Methods 2.14小节及Supporting Information Fig. S9 |