大规模人群外显子测序关联分析
探究罕见蛋白编码变异与TG:HDL比值的关联，识别能量代谢相关基因。
对来自11个队列、1,032,116人进行外显子测序，估计罕见编码变异与TG:HDL比值的关联，调整常见变异信号，识别59个独立基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
FNIP1变异与100万人中有利的代谢相关
FNIP1 variants are associated with favourable metabolism in 1 million humans
实验完整度
高包含103万人外显子测序关联分析，以及原代人肝细胞敲低、小鼠AAV8-gRNA肝脏敲除、GalNAc-siRNA和长期实验等多层功能验证。
主要模型
1,032,116人外显子测序队列（11个队列，美洲、欧洲和亚洲人群） 原代人肝细胞（供体HU8450，男性，HMCPTS） Cas9-Ready小鼠（雄性，10周龄，AAV8-gRNA肝脏敲除） C57BL/6NTac野生型小鼠（AAV8-shRNA或GalNAc-siRNA）
重点核对
外显子组关联分析样本量1,032,116人，罕见编码变异次要等位基因频率<1%，外显子组显著性阈值P < 1.04 × 10−7 FNIP1 pLOF变异等位基因频率0.01%，与TG:HDL比值降低约0.5 s.d.相关（P = 1.1 × 10−10） 原代人肝细胞siRNA敲低FNIP1，n = 6生物学重复，96小时后检测mRNA水平 Cas9-Ready雄性小鼠AAV8-gRNA给药剂量2.5 × 1010病毒基因组/只，高脂高果糖饮食，13周检测体重、脂肪量、胰岛素和肝脏甘油三酯 GalNAc-conjugated Flcn siRNA皮下注射10 mg/kg每10天一次，高脂高果糖饮食31天，n = 5只/组
摘要
能量代谢改变是心血管代谢疾病的共同驱动因素——心血管代谢疾病是全球主要死因。能量代谢在个体间存在差异，部分由遗传决定。在此，为探究能量代谢的遗传基础，我们对来自美洲、欧洲和亚洲的1,032,116人进行外显子组测序分析，并估计罕见蛋白编码变异与甘油三酯与高密度脂蛋白胆固醇比值（TG:HDL）——一种与多种心血管代谢危险因素和疾病相关的能量状态生物标志物——之间的关联。我们识别出59个独立基因（P < 1.04 × 10−7），这些基因富集于肝脏和脂肪组织中表达的能量平衡、储存和代谢的主调控因子；其中23个（39%）基因编码已批准或临床阶段的药物靶点。FNIP1中的超罕见蛋白截短变异（等位基因频率0.01%），其编码能量消耗和线粒体代谢的抑制因子，与较低的TG:HDL比值、较低的肝脏脂肪、较低的血糖、有利的脂肪分布以及心血管代谢疾病风险降低约60%相关。在原代人肝细胞中敲低FNIP1可诱导脂质分解和溶酶体基因表达，而联合敲低肝脏中的Fnip1及其旁系同源物Fnip2或敲低其相互作用因子Flcn，可在高脂饮食喂养的小鼠中防止体重增加、减少肝脏脂肪并增强胰岛素敏感性。我们的研究将FNIP1通路与人类能量代谢联系起来，并强调其抑制作为心血管代谢疾病的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能量代谢的遗传基础是什么，特别是罕见蛋白编码变异如何影响TG:HDL比值这一能量状态生物标志物及心血管代谢疾病风险。
- 核心机制
- FNIP1与FLCN形成复合物抑制TFEB和TFE3，从而抑制线粒体生物发生、氧化磷酸化和能量消耗；FNIP1功能丧失可诱导脂质分解和溶酶体基因表达，增强能量代谢。
- 主要证据
- 在1,032,116人中，FNIP1超罕见pLOF变异与较低TG:HDL比值、较低肝脏脂肪、较低血糖、有利脂肪分布及心血管代谢疾病风险降低约60%相关；原代人肝细胞中FNIP1敲低诱导脂质分解和溶酶体基因表达；小鼠肝脏Fnip1+Fnip2或Flcn敲除防止高脂饮食诱导的体重增加、减少肝脏脂肪并增强胰岛素敏感性。
- 研究意义
- 研究将FNIP1通路与人类能量代谢和心血管代谢疾病病因联系起来，并提示其抑制作为心血管代谢疾病的潜在治疗策略，尤其是通过肝细胞选择性siRNA沉默。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FNIP1变异与心血管代谢表型关联分析
验证FNIP1 pLOF变异与多种心血管代谢性状和疾病风险的关联。
在超过100万人中分析FNIP1 pLOF变异与血脂、体质指数、脂肪分布、血糖、肝脏脂肪和肝酶等性状及心血管代谢疾病结局的关联。
原代人肝细胞中FNIP1敲低
验证FNIP1敲低对人肝细胞代谢基因表达的影响。
使用siRNA在原代人肝细胞中敲低FNIP1，检测mRNA水平和溶酶体/脂质分解基因表达。
小鼠肝脏Fnip1、Fnip2和Flcn基因敲除
在体内评估肝脏FNIP-FLCN通路抑制对整体能量稳态的影响。
通过AAV8-gRNA在Cas9-Ready小鼠肝脏中敲除Flcn、Fnip1、Fnip2或Fnip1+Fnip2，高脂高果糖饮食喂养13周，检测体重、脂肪量、胰岛素、肝脏甘油三酯和基因表达。
GalNAc-siRNA肝细胞选择性Flcn敲低
验证肝细胞特异性Flcn敲低可重现AAV8-gRNA的表型。
使用GalNAc-conjugated Flcn siRNA皮下注射野生型小鼠，高脂高果糖饮食31天，检测肝脏Flcn mRNA和蛋白、体重、脂肪量、肝脏脂质和血浆胰岛素。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 外显子测序 | xGen外显子研究面板 | Integrated DNA Technology | -- |
| 人类综合外显子面板 | Twist Bioscience | -- | |
| Illumina HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 肝脏RNA-seq | NEBNext Poly(A) mRNA磁分离模块 | New England Biolabs | -- |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| Kapa HiFi聚合酶 | Roche | -- | |
| 小鼠实验 | AAV8-GFP-U6-m-Hpn-shRNA | Vector Biolabs | shAAV-261634 |
| AAV8-GFP-U6-scrmb-shRNA | Vector Biolabs | -- | |
| GalNAc偶联Flcn siRNA | Alnylam Pharmaceuticals | -- | |
| 对照啮齿动物饲料 | LabDiet | 5053 | |
| 高脂高果糖饮食 | Research Diets | D09100310 | |
| 肝脏脂质分析 | Infinity甘油三酯试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 血糖监测 | Accu-check血糖监测系统 | Roche | -- |
| 胰岛素检测 | 小鼠胰岛素ELISA试剂盒 | Mercodia | 10-1247-01 |
| RT-qPCR | TaqMan基因表达预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| QuantStudio 6 Flex实时PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 原代人肝细胞培养 | William’s E培养基 | Thermo Fisher Scientific | A1217601 |
| 原代肝细胞解冻/接种补充剂 | Thermo Fisher Scientific | CM3000 | |
| 胶原预包被12孔组织培养板 | Corning | 356500 | |
| 原代肝细胞维持补充剂，无血清 | Thermo Fisher Scientific | CM4000 | |
| siRNA转染 | Silencer Select siRNA FNIP1 s41304 | Thermo Fisher Scientific | 4392421 |
| siNeg Silencer siRNA 1 | Thermo Fisher Scientific | AM4635 | |
| Lipofectamine RNAiMax试剂 | Invitrogen | 13778150 | |
| OptiMEM培养基 | Gibco | 51985034 | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 免疫印迹 | 1× RIPA缓冲液 | EMD Millipore | 20-188 |
| 蛋白酶抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | PIA32955 | |
| DC蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 5000111 | |
| 4–20%梯度SDS–PAGE凝胶 | Bio-Rad | 5671093 | |
| PVDF膜 | Bio-Rad | 1704157 | |
| 抗人FNIP1抗体 | Cell Signaling | 36892 | |
| 抗HSP90抗体 | Cell Signaling | 4877 | |
| 增强化学发光检测系统 | EMD Millipore | WBULS0500 | |
| 免疫印迹成像 | Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare Life Sciences | -- |
| RNA-seq文库构建 | KAPA mRNA HyperPrep试剂盒 | Roche Sequencing | -- |
| xGen双索引UMI接头 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| RNA-seq测序 | NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| 质谱分析 | Thermo Scientific Exploris480质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 样本处理 | RNAlater组织收集系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 肝脏脂质分析 | ADVIA Chemistry XPT血液生化分析仪 | Bayer | -- |
| 胰岛素给药 | HumulinR | Lilly | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 外显子组关联分析 | 样本量1,032,116人、11个队列、罕见编码变异次要等位基因频率<1%、调整1,617个常见变异信号、外显子组显著性阈值P < 1.04 × 10−7 阅读提示：Methods中Study population、Genetic association analyses及Supplementary Table 1 |
| FNIP1变异与心血管代谢表型关联 | FNIP1 pLOF变异等位基因频率0.01%、心血管代谢疾病病例227,636例和对照265,114例、杂合状态、效应量OR = 0.39（95% CI = 0.22–0.69） 阅读提示：Results中FNIP1 pathway部分及Fig. 4a |
| 原代人肝细胞FNIP1敲低 | 供体HU8450（男性，HMCPTS）、siRNA浓度100 nM、转染后96小时收集、n = 6生物学重复、mRNA敲低>90% 阅读提示：Methods中Knockdown in primary human hepatocytes及Fig. 4b |
| 小鼠肝脏AAV8-gRNA基因敲除 | Cas9-Ready雄性小鼠10周龄、AAV8-gRNA剂量2.5 × 1010病毒基因组/只、高脂高果糖饮食、13周检测、各组n值（12/11/12/12/12） 阅读提示：Methods中Mouse models and procedures及Fig. 4c–f |
| GalNAc-siRNA肝细胞Flcn敲低 | 雄性WT小鼠11-15周龄、GalNAc-conjugated Flcn siRNA 10 mg/kg皮下注射每10天一次、高脂高果糖饮食31天、n = 5只/组 阅读提示：Methods中siRNA administration in vivo及Extended Data Fig. 9 |