iLSEP的定向分化
从hiPS细胞诱导肝窦内皮祖细胞。
采用2D微图案分化方法，依次使用BMP4、VEGF-A、CHIR99021、SCF、bFGF、SB431542、Flt-3 ligand、IL-3、TPO、IL-6、IL-11、IGF-1和EPO等因子，在特定时间点更换培养基，诱导CD34+CD31+CD32+ iLSEP。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
多能干细胞衍生的人肝芽类器官中正弦血管的自组织
Self-organization of sinusoidal vessels in pluripotent stem cell-derived human liver bud organoids
实验完整度
高体外2D/3D类器官模型、活体成像、动物移植及患者样本等多层级证据，含WNT2机制和功能验证
主要模型
hiPS细胞系1383D2、625A4和511-3E IMALI培养的+iLSEP HLBO类器官 NOD/SCID小鼠颅窗移植模型 NSI-FVIII KO血友病A小鼠模型
重点核对
iLSEP诱导分化中OSM浓度为10 ng ml−1，VEGF-A为5 ng ml−1，培养于37°C、5% CO2和5% O2 IMALI培养中iHE:iAEC:iSTM比例为10:7:1，iLSEP层细胞浓度为16.5 million cells per ml WNT2 siRNA在LNP中的最终浓度为200 nM APTT检测使用30 μl类器官培养上清与270 μl凝血因子缺陷血浆混合 HLBO移植：NSI-FVIII KO小鼠肝内移植三个组装后培养3天的类器官
摘要
在体外活体组织系统中诱导组织特异性血管仍具有挑战性。本研究通过调控发育通路，直接将人多能干细胞分化为CD32b+的假定肝窦祖细胞。通过设计的倒置多层气液界面培养，肝内胚层、隔膜间充质、动脉和正弦四重祖细胞自组织，生成并维持肝细胞样细胞，其邻近分布着由CD32blowCD31high、LYVE1+STAB1+CD32bhighCD31lowTHBD−vWF−和LYVE1−THBD+vWF+细胞组成的不同内皮亚群。WNT2介导正弦-肝细胞间细胞串扰，增强肝细胞分化和分支内皮网络形成。活体成像显示，iPS细胞衍生的假定肝窦内皮祖细胞发育为完全灌注的人血管，具有功能性类正弦特征。类器官衍生的肝细胞和正弦衍生凝血因子能够在体外用凝血因子V、VIII、IX和XI缺陷血浆纠正凝血时间，并在移植后挽救血友病A小鼠的严重出血表型。先进的类器官血管化技术允许探究控制器官特异性血管发育的关键见解，为凝血障碍治疗铺平道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何从人多能干细胞中诱导肝窦内皮祖细胞，并在3D类器官中自组织形成器官特异性正弦血管，以及这些血管化类器官能否产生功能性凝血因子并纠正凝血障碍。
- 核心机制
- WNT2介导正弦内皮祖细胞与肝内胚层之间的细胞间串扰，增强肝细胞分化和分支内皮网络形成；OSM信号通路促进iLSEP向LSEC分化。
- 主要证据
- 通过单细胞RNA-seq、免疫荧光、流式细胞术和活体成像，在+iLSEP HLBO中观察到肝窦样内皮网络形成和肝细胞功能成熟；siWNT2敲低导致ASGR1+和GS+肝细胞减少、血管密度降低和FVIII分泌下降；HLBO上清在FVIII缺陷血浆中缩短APTT，并在血友病A小鼠中减少出血时间和失血量。
- 研究意义
- 建立了从hiPS细胞诱导iLSEP并自组织形成含肝窦样血管的肝芽类器官的方法，为研究器官特异性血管发育和凝血障碍治疗提供了平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
iLSEP向LSEC诱导分化
验证iLSEP在OSM信号激活下分化为LSEC样细胞。
将CD34+ iLSEP分选后接种于Matrigel包被的24孔板，在EGM和肝细胞培养基混合液中加入Rock inhibitor和VEGF-A，有或无OSM处理，培养至day 14，通过流式细胞术、免疫细胞化学、扫描电镜和ELISA检测LSEC标志物和FVIII分泌。
IMALI培养自组织形成HLBO
建立3D类器官培养条件，使肝和内皮亚群自组织形成肝芽样类器官。
使用倒置多层气液界面培养，在transwell插入物膜上依次添加Matrigel底层、第一层含iHE、iAEC和iSTM的细胞层、第二层含iLSEP的细胞层，胶凝后置于超低吸附板中培养，形成HLBO。
HLBO的体内移植与血管功能评估
评估HLBO在体内形成功能性血管网络的能力。
将培养3天的HLBO植入免疫缺陷小鼠颅窗或肝脏，通过活体成像、免疫荧光和APTT检测血管灌注、通透性和FVIII分泌。
WNT2信号机制验证
研究WNT2介导的细胞间串扰在HLBO功能化中的作用。
在IMALI培养中通过LNP-siRNA复合物对iLSEP特异性敲低WNT2，然后通过免疫荧光、流式细胞术和ELISA检测肝细胞标志物、血管密度和FVIII分泌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| iPS细胞培养 | iMatrix-511 | Nippi | 892012 |
| StemFit AK02N培养基 | Ajinomoto | AJ100 | |
| iLSEP诱导分化 | 骨形态发生蛋白4 | R&D | 314-BP |
| 血管内皮生长因子A | Invitrogen | PHC9393 | |
| CHIR99021 | Cayman Chemical | 13122 | |
| 干细胞因子 | R&D | 255-SC | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | FUJIFILM Wako | 060-04543 | |
| SB431542 | FUJIFILM Wako | 033-24631 | |
| Flt-3配体 | R&D | 308-FK | |
| 白细胞介素3 | R&D | 203-IL | |
| 血小板生成素 | R&D | 288-TPN | |
| 白细胞介素6 | R&D | 206-IL | |
| 白细胞介素11 | R&D | 218-IL | |
| 胰岛素样生长因子1 | R&D | 291-G1 | |
| 促红细胞生成素 | PeproTech | 100-64 | |
| LSEC诱导分化 | 基质胶 | Corning | 354230 |
| 内皮细胞生长培养基 | Lonza | CC-3124 | |
| 肝细胞培养基 | Lonza | CC-3198 | |
| Y-27632 | FUJIFILM Wako | 034-24024 | |
| 抑瘤素M | R&D | 295-OM | |
| IMALI培养 | 悬挂式细胞培养插入物 | Millipore | MCEP06H48 |
| 地塞米松 | Sigma-Aldrich | D2915 | |
| 肝细胞生长因子 | STEMCELL Technologies | 78019 | |
| 超低吸附六孔板 | Corning | 3471 | |
| 免疫荧光染色 | Triton-X | NACALAI TESQUE | 35501-02 |
| 驴血清 | Millipore | S30 | |
| DAPI | DOJINDO | D523 | |
| 扫描电镜 | 扫描电子显微镜 | JEOL | JSM-7900F |
| 临界点干燥仪 | JEOL | JCPD-5 | |
| scRNA-seq | Liberase TM | Roche | 5401119001 |
| DNase I | Sigma | 11284932001 | |
| NextGEM单细胞3′ v.3.1试剂盒 | 10x Genomics | 1000269 | |
| RNA提取与建库 | PureLink RNA mini试剂盒 | Invitrogen | 12183025 |
| SuperScript VILO cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | 11754250 | |
| Ion AmpliSeq转录组人基因表达试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A31446 | |
| Agencourt AMPure XP试剂 | Beckman Coulter | A63880 | |
| Ion文库TaqMan定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4468802 | |
| Ion 540芯片试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A27766 | |
| Ion 540 Kit-Chef | Life Technologies | A30011 | |
| RT-qPCR | 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368813 |
| TaqMan基因表达预混液 | Applied Biosystems | 4370048 | |
| 全组织透明化与成像 | SCALEVIEW-S | FUJIFILM Wako | 299-79901 |
| 透射免疫电镜 | 抗LYVE1抗体 | abcam | ab36993 |
| 纳米金标记的山羊抗兔IgG Fab’片段抗体 | Nanoprobes | 2003 | |
| siRNA转染 | Silencer Select WNT2 siRNA | Thermo Fisher Scientific | s14865/s14866/s14867 |
| BLOCK-iT Alexa Fluor红色荧光对照 | Thermo Fisher Scientific | 14750100 | |
| 谷氨酰胺代谢分析 | T-PER组织蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | 78510 |
| NanoOrange蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | N6666 | |
| 谷氨酰胺合成酶活性检测试剂盒 | Abcam | ab284572 | |
| 谷氨酰胺/谷氨酸-Glo检测 | Promega | J8021 | |
| 氨检测试剂盒 | Abcam | ab83360 | |
| APTT检测 | 重组人凝血因子VIII | PROSPEC | PRO-318 |
| CRYOcheck凝血因子缺陷血浆 | Precision BioLogic | FDP05/FDP08/FDP09/FDP11 | |
| FVIII抑制剂血浆 | Affinity Biologicals | INH8DP | |
| 阴性FVIII抑制剂对照 | Precision BioLogic | CCIK08 | |
| 凝血酶生成试验 | SMAT-FVIII/FIX试剂盒 | Thrombo Translational Research Lab Inc. | VIII-001a |
| 纤维蛋白凝块 | Alexa Fluor 488标记的纤维蛋白原 | Invitrogen | F13191 |
| 活体成像 | 四甲基罗丹明标记的葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D7139 |
| Texas Red标记的葡聚糖 | Thermo Fisher Scientific | D1864 | |
| Alexa Fluor 647标记的抗小鼠CD31抗体 | BioLegend | 102516 | |
| 乙酰化低密度脂蛋白 | Thermo Fisher Scientific | L35354 | |
| 出血试验 | Amicon超离心过滤器 | Merck | UFC9010 |
| 移植 | Beriplast P Combi-Set | CSL Behring | -- |
| 美洛昔康 | Boehringer Ingelheim | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iLSEP诱导分化 | BMP4 80 ng ml−1、VEGF-A 80 ng ml−1、CHIR99021 2 μM、SCF 50 ng ml−1、bFGF 25 ng ml−1、SB431542 2 μM等因子浓度及换液时间点（day 2, 4, 6） 阅读提示：Methods 'iLSEP induction'小节及Fig. 1a |
| LSEC诱导分化 | OSM 10 ng ml−1、VEGF-A 5 ng ml−1、Rock inhibitor 10 μM、细胞密度8.8 × 104 cells per well、培养条件37°C, 5% CO2, 5% O2 阅读提示：Methods 'LSEC induction'小节及Extended Data Fig. 2f |
| IMALI培养形成HLBO | iHE:iAEC:iSTM比例10:7:1、第一层细胞浓度44 million cells per ml、第二层iLSEP浓度16.5 million cells per ml、Matrigel稀释比例1:1、培养基添加因子（dexamethasone 0.1 mM, OSM 10 ng ml−1, HGF 20 ng ml−1等） 阅读提示：Methods 'Formation of HLBO by IMALI culture'小节及Fig. 1a |
| WNT2敲低 | siRNA最终浓度200 nM、LNP-siRNA复合物与iLSEP混合于凝胶中 阅读提示：Methods 'siRNA transfection'小节 |
| APTT检测 | 30 μl培养上清与270 μl凝血因子缺陷血浆混合、热灭活条件56°C 1 h、FVIII抑制剂滴定7.52 BU ml−1 阅读提示：Methods 'Analysis of APTT'小节 |
| HLBO移植 | NSI-FVIII KO小鼠、移植三个组装后培养3天的类器官、移植前静脉注射200 μl 50 U kg−1 rhFVIII、移植后使用meloxicam 5 mg kg−1 阅读提示：Methods 'Transplantation of HLBOs into liver'小节 |