多工程化T细胞疫苗增强TCR-T细胞疗法抗肿瘤功能并根除异质性实体瘤

Multi-engineered T cell vaccine boosting TCR-T cell therapy enhances anti-tumor function and eradicates heterogeneous solid tumors

作者信息Xuan Che, Shen Zheng, Yuan Sun, Xiya Wang, Pengchong Zhang, Jixiang Cao, Yun Bai

PMID40450522

期刊Mol Ther

发布时间2025-09-03

DOI10.1016/j.ymthe.2025.05.036

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实验完整度

高

本研究包含体外细胞共培养、异质性肿瘤模型、体内疗效验证、单细胞测序和TCR测序等多层次实验验证。

主要模型

MC38-OVA小鼠结肠癌模型 MC38和MC38-OVA混合异质性肿瘤模型 BMDC OT1 TCR-T细胞

重点核对

MC38-OVA细胞皮下注射剂量5×10^5 放射预处理500 cGy TCR-T细胞和Multi-Tvac注射剂量1×10^6细胞/只注射时间：第7、14、21天肿瘤体积测量频率每周三次

摘要

T细胞受体(TCR)工程化T细胞疗法在治疗实体瘤方面前景广阔，但其整体临床疗效仍然有限。关键挑战在于TCR靶向抗原的丢失和T细胞持久性差。在此，我们展示了一种通过多工程化T细胞疫苗(Multi-Tvac)增强TCR-T细胞疗法并排斥抗原异质性肿瘤的新方法。Multi-Tvac由TCR靶向同源肽、肿瘤新抗原和LAG-3Ig佐剂信号组成，可显著促进树突状细胞(DC)成熟，增强TCR-T细胞抗肿瘤功能，并减轻耗竭表型。当与TCR-T细胞疗法联合使用时，Multi-Tvac在对TCR-T细胞单一疗法耐药的已建立实体瘤中诱导了长效反应。值得注意的是，Multi-Tvac阻止了抗原丢失型肿瘤逃逸，并在抗原异质性实体瘤模型中实现了完全缓解。机制上，Multi-Tvac增强了次级淋巴器官(SLOs)中的抗原呈递，协调了强大的内源性免疫反应以启动T细胞。作为概念验证，我们的研究将T细胞工程扩展到了TCR定向杀伤之外，可作为治疗性疫苗平台，赋予TCR-T细胞新的能力，并克服实体瘤临床治疗中的主要障碍。

建立实验模型并明确TCR-T单药治疗局限

验证TCR-T细胞单一疗法对实体瘤的疗效及局限性

将MC38-OVA和MC38细胞分别植入小鼠两侧，预处理后输注OT1 TCR-T细胞，监测肿瘤生长和T细胞持久性。

构建TSAs-Tvac和LAG-3Ig并验证其功能

评估TSAs-Tvac作为疫苗和LAG-3Ig作为佐剂的能力

构建表达新抗原和OVA表位的TSAs-Tvac，检测其诱导内源T细胞反应；构建表达LAG-3Ig的细胞，验证其对DC成熟和T细胞增殖的促进。

构建Multi-Tvac并体外验证其功能

验证Multi-Tvac对DC和T细胞的影响

将TSAs-Tvac和LAG-3Ig共表达于T细胞，体外与DC共培养，检测DC表型和T细胞功能。

体内评估Multi-Tvac联合TCR-T疗法的抗肿瘤疗效

验证联合治疗在已建立实体瘤模型中的疗效

MC38-OVA荷瘤小鼠接受TCR-T或联合Multi-Tvac治疗，监测肿瘤体积、生存率、肿瘤组织病理和免疫浸润。

研究Multi-Tvac对过继TCR-T细胞的影响

探索联合治疗增强疗效的免疫机制

监测外周血、淋巴结和肿瘤中的TCR-T细胞数量表型和功能，并进行转录组分析。

研究Multi-Tvac对内源性T细胞反应的影响

评估联合治疗激活内源性抗肿瘤免疫的能力

检测肿瘤和淋巴结中内源性新抗原特异性T细胞反应、细胞因子分泌和转录组变化。

评估联合治疗在异质性肿瘤模型中的疗效

验证Multi-Tvac克服抗原异质性肿瘤逃逸的能力

建立OVA+和OVA-肿瘤混合模型，比较不同治疗组肿瘤体积和T细胞反应；进行再挑战实验。

明确SLOs中DC介导的交叉呈递机制

阐明Multi-Tvac在体内增强T细胞启动的机制

利用DiI标记追踪Multi-Tvac被DC摄取情况，并验证DC激活T细胞的功能。

验证人源Multi-Tvac（hMulti-Tvac）的体外功能

证明hMulti-Tvac在人类细胞中的潜力

用hMulti-Tvac脉冲自体DC，检测其对KRAS或NY-ESO-1 TCR-T细胞活化和功能的影响。

实验环节	名称	品牌	货号
细胞培养	DMEM培养基	Gibco	--
RPMI 1640培养基	--	--
胎牛血清	Gibco	--
谷氨酰胺补充剂	Gibco	--
青霉素/链霉素	Gibco	--
β-巯基乙醇	Sigma	--
X-VIVO 15培养基	Lonza	--
T细胞分离	EasySep小鼠T细胞分离试剂盒	STEMCELL	19851
EasySep小鼠T细胞分离试剂盒	STEMCELL	--
T细胞激活	抗小鼠CD3抗体	BioLegend	--
抗小鼠CD28抗体	BioLegend	--
重组人白细胞介素-2	Peprotech	200-02
细胞因子	小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子	Peprotech	--
小鼠白细胞介素-4	Peprotech	--
处理	脂多糖	Sigma	L2880
细胞处理	肽	Genscript	--
疫苗佐剂	聚肌胞苷酸	InvivoGen	--
流式细胞术	Zombie NIR可固定活力试剂盒	BioLegend	423106
TruStain FcX抗小鼠CD16/32	BioLegend	101320
Quick Switch Quant H-2Kb四聚体试剂盒PE	MBL	TB-7400-K1
固定缓冲液	BioLegend	420801
胞内染色透化洗涤缓冲液(10x)	BioLegend	421002
CytoFLEX流式细胞仪	Beckman Coulter	--
细胞培养	Transwell小室	Corning	--
HitransG P转染增强剂	Genechem	REVG005
病毒转导	聚凝胺	Millipore	--
病毒包装	磷酸钙	Sigma	--
聚乙二醇8000	Sigma	--
Millex-GP过滤器	Millipore	--
细胞分离	氯化铵	STEMCELL	07800
脱氧核糖核酸酶I	--	--
IV型胶原酶	--	--
Percoll分离液	--	--
细胞筛网	Falcon	--
小鼠树突状细胞分离试剂盒	STEMCELL	--
FACSAria流式分选仪	BD Biosciences	--
ELISpot	小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒	Dakewe	2210005
IFN-γ捕获抗体	Dakewe	--
细胞处理	DiI染料	Thermo Fisher Scientific	--
含布雷菲德菌素A的细胞活化混合物	BioLegend	423303
细胞分离	人淋巴细胞分离液	Dakewe	--
T细胞激活	抗CD3/CD28磁珠	Thermo Fisher Scientific	--
细胞处理	牛血清白蛋白	--	--
组织学检测	链霉亲和素-过氧化物酶	Roche	--
抗CD3抗体	Abcam	--
抗CD8抗体	Abcam	--
抗PCNA抗体	Abcam	--
DAPI染色液	Abcam	--
显微镜	光学显微镜	Olympus	CX41-23C02
RNA测序	Trizol试剂	Invitrogen	--
Agilent 2100生物分析仪	Agilent Technologies	--
NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒	NEB	--
AMPure XP磁珠	--	--
Illumina NovaSeq 6000测序仪	Illumina	--
单细胞测序	Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒	10x Genomics	--
NovaSeq 6000测序仪	Illumina	--
抗体	抗小鼠CD3抗体 (克隆: 17A2)	BioLegend	--
抗小鼠CD4抗体 (克隆: RM4-4)	BioLegend	--
抗小鼠CD8抗体 (克隆: KT15)	MBL	--
抗小鼠4-1BB抗体 (克隆: 17B5)	BioLegend	--
抗小鼠OX40抗体 (克隆: OX-86)	BioLegend	--
抗小鼠CD69抗体 (克隆: H1.2F3)	BioLegend	--
抗小鼠穿孔素抗体 (克隆: S16009A)	BioLegend	--
抗小鼠颗粒酶B抗体 (克隆: QA16A02)	BioLegend	--
抗小鼠CD107a抗体 (克隆: 1D4B)	BioLegend	--
抗小鼠PD-1抗体 (克隆: 29F.1A12)	BioLegend	--
抗小鼠TIM-3抗体 (克隆: RMT3-23)	BioLegend	--
抗小鼠LAG-3抗体 (克隆: C9B7W)	BioLegend	--
抗小鼠CD62L抗体 (克隆: MEL-14)	BioLegend	--
抗小鼠CD44抗体 (克隆: IM7)	BioLegend	--
抗小鼠CD11c抗体 (克隆: N418)	BioLegend	--
抗小鼠I-A/I-E抗体 (克隆: M5/114.15.2)	BioLegend	--
抗小鼠CD40抗体 (克隆: 3/23)	BioLegend	--
抗小鼠CD80抗体 (克隆: 16-10A1)	BioLegend	--
抗小鼠CD86抗体 (克隆: GL-1)	BioLegend	--
抗小鼠IL-12抗体 (克隆: C15.6)	BioLegend	--
抗小鼠IFN-γ抗体 (克隆: XMG1.2)	BioLegend	--
抗小鼠TNF-α抗体 (克隆: MP6-XT22)	BioLegend	--
抗小鼠H-2Kb结合SIINFEKL抗体 (克隆: 25-D1.16)	BioLegend	--
抗人LNGFR抗体 (克隆: ME20.4)	BioLegend	--
抗人CD8抗体 (克隆: SK1)	BioLegend	--
抗人CD4抗体 (克隆: RPA-T4)	BioLegend	--
抗人PD-1抗体 (克隆: EH12.2H7)	BioLegend	--
抗人TIM-3抗体 (克隆: F38-2E2)	BioLegend	--
抗人LAG-3抗体 (克隆: 11C3C65)	BioLegend	--
细胞因子	白细胞介素-1β	--	--
白细胞介素-6	--	--
前列腺素E2	--	--
肿瘤坏死因子-α	--	--

实验环节

名称

品牌

货号

细胞培养

Gibco

Gibco

Gibco

Gibco

Sigma

Lonza

T细胞分离

EasySep小鼠T细胞分离试剂盒

STEMCELL

19851

EasySep小鼠T细胞分离试剂盒

STEMCELL

T细胞激活

抗小鼠CD3抗体

BioLegend

抗小鼠CD28抗体

BioLegend

重组人白细胞介素-2

Peprotech

200-02

细胞因子

小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子

Peprotech

小鼠白细胞介素-4

Peprotech

处理

脂多糖

Sigma

L2880

细胞处理

肽

Genscript

疫苗佐剂

聚肌胞苷酸

InvivoGen

流式细胞术

Zombie NIR可固定活力试剂盒

BioLegend

423106

TruStain FcX抗小鼠CD16/32

BioLegend

101320

Quick Switch Quant H-2Kb四聚体试剂盒PE

MBL

TB-7400-K1

固定缓冲液

BioLegend

420801

胞内染色透化洗涤缓冲液(10x)

BioLegend

421002

CytoFLEX流式细胞仪

Beckman Coulter

细胞培养

Transwell小室

Corning

HitransG P转染增强剂

Genechem

REVG005

病毒转导

聚凝胺

Millipore

病毒包装

磷酸钙

Sigma

聚乙二醇8000

Sigma

Millex-GP过滤器

Millipore

细胞分离

氯化铵

STEMCELL

07800

Falcon

STEMCELL

BD Biosciences

ELISpot

小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒

Dakewe

2210005

IFN-γ捕获抗体

Dakewe

细胞处理

DiI染料

Thermo Fisher Scientific

含布雷菲德菌素A的细胞活化混合物

BioLegend

423303

细胞分离

人淋巴细胞分离液

Dakewe

T细胞激活

抗CD3/CD28磁珠

Thermo Fisher Scientific

细胞处理

组织学检测

Roche

Abcam

Abcam

Abcam

Abcam

显微镜

光学显微镜

Olympus

CX41-23C02

RNA测序

Trizol试剂

Invitrogen

Agilent 2100生物分析仪

Agilent Technologies

NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒

NEB

AMPure XP磁珠

Illumina NovaSeq 6000测序仪

Illumina

单细胞测序

Chromium单细胞V(D)J富集试剂盒

10x Genomics

NovaSeq 6000测序仪

Illumina

抗体

抗小鼠CD3抗体 (克隆: 17A2)

BioLegend

抗小鼠CD4抗体 (克隆: RM4-4)

BioLegend

抗小鼠CD8抗体 (克隆: KT15)

MBL

抗小鼠4-1BB抗体 (克隆: 17B5)

BioLegend

抗小鼠OX40抗体 (克隆: OX-86)

BioLegend

抗小鼠CD69抗体 (克隆: H1.2F3)

BioLegend

抗小鼠穿孔素抗体 (克隆: S16009A)

BioLegend

抗小鼠颗粒酶B抗体 (克隆: QA16A02)

BioLegend

抗小鼠CD107a抗体 (克隆: 1D4B)

BioLegend

抗小鼠PD-1抗体 (克隆: 29F.1A12)

BioLegend

抗小鼠TIM-3抗体 (克隆: RMT3-23)

BioLegend

抗小鼠LAG-3抗体 (克隆: C9B7W)

BioLegend

抗小鼠CD62L抗体 (克隆: MEL-14)

BioLegend

抗小鼠CD44抗体 (克隆: IM7)

BioLegend

抗小鼠CD11c抗体 (克隆: N418)

BioLegend

抗小鼠I-A/I-E抗体 (克隆: M5/114.15.2)

BioLegend

抗小鼠CD40抗体 (克隆: 3/23)

BioLegend

抗小鼠CD80抗体 (克隆: 16-10A1)

BioLegend

抗小鼠CD86抗体 (克隆: GL-1)

BioLegend

抗小鼠IL-12抗体 (克隆: C15.6)

BioLegend

抗小鼠IFN-γ抗体 (克隆: XMG1.2)

BioLegend

抗小鼠TNF-α抗体 (克隆: MP6-XT22)

BioLegend

抗小鼠H-2Kb结合SIINFEKL抗体 (克隆: 25-D1.16)

BioLegend

抗人LNGFR抗体 (克隆: ME20.4)

BioLegend

抗人CD8抗体 (克隆: SK1)

BioLegend

抗人CD4抗体 (克隆: RPA-T4)

BioLegend

抗人PD-1抗体 (克隆: EH12.2H7)

BioLegend

抗人TIM-3抗体 (克隆: F38-2E2)

BioLegend

抗人LAG-3抗体 (克隆: 11C3C65)

BioLegend

细胞因子

环节	核对要点
肿瘤模型建立	MC38-OVA细胞皮下注射剂量为5×10^5，异质性模型为MC38-OVA与MC38 1:1混合共3×10^5+3×10^5 阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments
预处理	500 cGy亚致死照射阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments
T细胞制备	OT1 TCR-T细胞使用pMSGV逆转录病毒载体转导，LNGFR标记阅读提示：Materials and methods - Mouse retroviral constructs, T cell isolation, and retroviral transduction
治疗给药	TCR-T细胞和Multi-Tvac均为1×10^6细胞/只静脉注射；Multi-Tvac在TCR-T后第7、14、21天重复给药阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments
体外共培养	DC与Multi-Tvac以1:1比例非接触共培养48小时阅读提示：Materials and methods - DC stimulation and in vitro co-cultured assay
抗原肽	合成肽纯度95%，免疫小鼠使用100 μg长肽+50 μg poly(I:C) 阅读提示：Materials and methods - Peptide immunization of mice

环节

核对要点

肿瘤模型建立

MC38-OVA细胞皮下注射剂量为5×10^5，异质性模型为MC38-OVA与MC38 1:1混合共3×10^5+3×10^5

阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments

预处理

500 cGy亚致死照射

阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments

T细胞制备

OT1 TCR-T细胞使用pMSGV逆转录病毒载体转导，LNGFR标记

阅读提示：Materials and methods - Mouse retroviral constructs, T cell isolation, and retroviral transduction

治疗给药

TCR-T细胞和Multi-Tvac均为1×10^6细胞/只静脉注射；Multi-Tvac在TCR-T后第7、14、21天重复给药

阅读提示：Materials and methods - Tumor models and treatments

体外共培养

DC与Multi-Tvac以1:1比例非接触共培养48小时

阅读提示：Materials and methods - DC stimulation and in vitro co-cultured assay

抗原肽

合成肽纯度95%，免疫小鼠使用100 μg长肽+50 μg poly(I:C)

阅读提示：Materials and methods - Peptide immunization of mice

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