细菌感染诱导巨噬细胞焦亡的表征
验证E. tarda感染能否诱导人巨噬细胞焦亡及其依赖的炎症小体组分
用E. tarda感染分化的THP-1细胞，检测细胞死亡、IL-1β释放、caspase-1活化及GSDMD裂解，并使用CytoB/CytoD抑制细菌内化；结合基因敲除/敲低细胞系鉴定关键炎症小体组分。
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T3SS转位子通过与NLRC4/NAIP炎症小体直接相互作用诱导细胞焦亡
T3SS translocon induces pyroptosis by direct interaction with NLRC4/NAIP inflammasome.
实验完整度
高包含细菌感染模型、蛋白电转、炎症小体重构、基因敲除/敲低、免疫共沉淀及同源蛋白功能验证等多个独立证据层级，且包含功能和机制验证。
主要模型
人巨噬细胞（PMA分化THP-1细胞） HEK293T细胞（NLRC4炎症小体重构） 迟缓爱德华氏菌感染模型
重点核对
EseB蛋白的C端末端6个残基（T6R）是激活NLRC4/NAIP炎症小体的关键序列 EseB与NAIP的直接结合 THP-1细胞中NLRC4、Casp4、GSDMD等基因的敲除/敲低对细胞焦亡的影响 EseB同源物在所有测试菌株中均能激活NLRC4/NAIP炎症小体
摘要
三型分泌系统（T3SS）是许多细菌病原体存在的毒力装置。结构上，T3SS由基座、针状体、尖端和转位子组成。NLRC4炎症小体是T3SS针状体和基底杆蛋白的主要受体。其他T3SS组分是否被NLRC4识别尚不清楚。在本研究中，以迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda）作为胞内病原体模型，我们研究了T3SS-炎症小体相互作用及其对细胞死亡的影响。E. tarda以需要细菌转位子和宿主炎症小体蛋白NLRC4、NLRP3、ASC和caspase 1/4的方式诱导细胞焦亡。转位子蛋白EseB通过其C端区域，特别是末端6个残基（T6R）与NAIP结合，触发NLRC4/NAIP介导的细胞焦亡。EseB同源物广泛存在于T3SS阳性细菌中，且在T6R区域具有高度同一性。与E. tarda EseB一样，所有EseB同源物的代表均表现出T6R依赖的NLRC4激活能力。这些结果共同揭示了EseB诱导宿主细胞焦亡的功能和分子机制，并提示T3SS转位子在细菌病原体中存在高度保守的炎症小体激活机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- T3SS转位子蛋白是否以及如何被NLRC4炎症小体识别并诱导宿主细胞焦亡？
- 核心机制
- EseB蛋白通过其C端T6R基序与NAIP直接结合，激活NLRC4/NAIP炎症小体，进而激活caspase-1和GSDMD，诱导细胞焦亡。
- 主要证据
- 在THP-1巨噬细胞中，胞内EseB诱导细胞死亡和caspase-1/GSDMD活化，且依赖NLRC4/NAIP；免疫共沉淀证明EseB与NAIP结合；在HEK293T重构系统中，EseB及其同源物通过T6R激活NLRC4炎症小体。
- 研究意义
- 揭示了T3SS转位子蛋白激活宿主炎症小体的新机制，提示该机制在T3SS阳性细菌病原体中高度保守，加深了对病原体-宿主互作的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定转位子对焦亡的必需性
确定T3SS转位子蛋白在E. tarda诱导焦亡中的作用
构建转位子基因缺失突变株（ΔeseB、ΔescA、ΔeseC、ΔeseD、ΔeseB-D），检测其对宿主细胞死亡、IL-1β释放、caspase-1/GSDMD活化及Casp4活化的影响。
验证胞内EseB足以诱导焦亡
测试单个转位子蛋白EseB是否足以触发焦亡及其炎症小体依赖性
将纯化的EseB蛋白通过电穿孔导入THP-1细胞，检测细胞死亡和caspase-1/GSDMD活化；使用不同基因敲除/敲低细胞系及NAIP敲低细胞验证其依赖的炎症小体组分。
定位EseB的功能关键区域
确定EseB激活NLRC4/NAIP炎症小体所需的序列区域
构建EseB截短突变体（NT、CT、ΔT4R、ΔT6R），在THP-1细胞和NLRC4重构293T细胞中检测其诱导细胞死亡和激活NLRC4的能力；通过免疫共沉淀检测EseB突变体与NAIP的结合。
验证EseB同源物的保守激活功能
评估EseB同源物在不同致病菌中是否保守地激活NLRC4/NAIP炎症小体
从多种T3SS阳性细菌中鉴定EseB同源物，在NLRC4重构293T细胞中检测其激活能力；对部分同源物进行T6R缺失突变，验证其功能必要性；分析低同源性转位蛋白（如PcrV、LcrV等）的激活能力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 多粘菌素B | Solarbio | P8350 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099-141 | |
| 青霉素-链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C22400500 | |
| 佛波酯 | -- | -- | |
| 细菌感染 | 细胞松弛素B | Abcam | ab143482 |
| 细胞松弛素D | Invitrogen | PHZ1063 | |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| 蛋白电穿孔 | 细胞穿孔培养基T | BTXpress | 47-0002 |
| Gemini X2电穿孔仪 | BTX | 45-2006 | |
| OPTI-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 重组蛋白表达 | 异丙基β-D-硫代半乳糖苷 | Solarbio | I8070 |
| pET-28a质粒 | Novagen | 69864 | |
| 大肠杆菌BL21(DE3) | TransGen Biotech | CD601 | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖 | Qiagen | 30210 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| 细胞死亡检测 | CytoTox 96非放射性细胞毒性检测试剂盒 | Promega | G1780 |
| ELISA | 人IL-1β ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC002B |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 免疫沉淀 | anti-FLAG M2磁珠 | Sigma | M8823 |
| Western blot | Caspase-1抗体 | Cell Signaling Technology | 2225 |
| GSDMD抗体 | Cell Signaling Technology | 96458 | |
| IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12703 | |
| Caspase-4抗体 | Cell Signaling Technology | 42264T | |
| 抗6x His标签抗体 | Abcam | ab213204 | |
| flag标签抗体 | ABclonal | AE063 | |
| HA标签抗体 | ABclonal | AE008 | |
| Myc标签抗体 | ABclonal | AE010 | |
| β-肌动蛋白抗体 | ABclonal | AC004 | |
| HRP标记山羊抗小鼠IgG | ABclonal | AS003 | |
| HRP标记山羊抗兔IgG | Abcam | ab97051 | |
| 基因敲除/敲低 | pLKO.1 puro载体 | Addgene | 8453 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌感染 | E. tarda及其突变株（ΔeseB、ΔescA、ΔeseC、ΔeseD、ΔeseB-D、ΔfliC）的培养和感染条件，包括MOI=10、离心和孵育温度30°C、庆大霉素处理浓度和时长 阅读提示：Materials and methods, "E. tarda infection in THP-1 cells" |
| 细胞死亡和炎症小体检测 | THP-1细胞分化、感染时间（2和4小时）、LDH释放检测、IL-1β ELISA、Casp1/GSDMD免疫印迹、Casp4活化检测 阅读提示：Materials and methods, "E. tarda infection in THP-1 cells" and Figure legends 1-2 |
| 胞内蛋白电穿孔 | THP-1细胞密度、蛋白浓度（2 μg/1×10^6细胞）、电穿孔参数（300V，10ms，1脉冲）、孵育时间1小时 阅读提示：Materials and methods, "Protein electroporation" |
| NLRC4炎症小体重构 | HEK293T细胞转染的质粒组合和用量（proIL-1β 2μg、NLRC4 100ng、NAIP 100ng、Casp1 25ng、EseB 100ng）、转染试剂Lipofectamine 3000、检测时间24小时 阅读提示：Materials and methods, "NLRC4 inflammasome reconstitution in HEK293T cells" |
| EseB功能关键区域验证 | EseB截短突变体（NT、CT、ΔT4R、ΔT6R）的制备和电穿孔条件、免疫沉淀检测EseB与NAIP结合 阅读提示：Figure 4 legends and Materials and methods, "Immunoblotting and immunoprecipitation" |