建立致死性内毒素血症模型
模拟致死性炎症损伤，研究SIRT1激活剂的作用
C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS（10 mg/kg）诱导内毒素血症。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Sirtuin 1激活剂通过促进丙酮酸激酶M2的自噬降解减轻致死性炎症损伤
Sirtuin 1 activator alleviated lethal inflammatory injury via promotion of autophagic degradation of pyruvate kinase M2.
实验完整度
高本研究包含体内动物模型、多种干预（SIRT1激活剂、自噬抑制剂、溶酶体抑制剂）、功能验证（炎症因子、肺损伤、多器官损伤、生存率）及机制验证（自噬标志物、AMPK/mTOR通路）。
主要模型
C57BL/6J小鼠致死性内毒素血症模型（LPS诱导）
重点核对
LPS剂量：10 mg/kg，腹腔注射 SRT2104剂量：25 mg/kg，腹腔注射，LPS前30分钟 3-MA剂量：15 mg/kg，腹腔注射，SRT2104前30分钟 BafA1剂量：1 mg/kg，腹腔注射，SRT2104前30分钟 检测时间点：LPS后8小时
摘要
丙酮酸激酶M2（PKM2）的上调对于危重症中代谢和炎症的协调至关重要，而自噬降解是最近揭示的对抗PKM2的机制。越来越多的证据表明，sirtuin 1（SIRT1）在自噬中起关键调节作用。本研究探讨了SIRT1激活剂是否通过促进PKM2的自噬降解来下调致死性内毒素血症中的PKM2。结果表明，致死剂量的脂多糖（LPS）暴露降低了SIRT1的水平。使用SIRT1激活剂SRT2104治疗可逆转LPS诱导的LC3B-II下调和p62上调，这与PKM2水平降低相关。雷帕霉素激活自噬也导致PKM2减少。在SRT2104处理的小鼠中，PKM2的下降伴随着炎症反应的减弱、肺损伤的减轻、血尿素氮（BUN）和脑钠肽（BNP）升高的抑制以及实验动物存活率的提高。此外，共同给予自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤或溶酶体抑制剂巴弗洛霉素A1可消除SRT2104对PKM2丰度、炎症反应和多器官损伤的抑制作用。因此，促进PKM2的自噬降解可能是SIRT1激活剂抗炎益处的新机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SIRT1激活剂是否通过促进PKM2的自噬降解来减轻致死性炎症损伤？
- 核心机制
- SIRT1激活剂SRT2104通过激活自噬，促进PKM2的溶酶体依赖性降解，从而降低PKM2水平，抑制炎症反应和多器官损伤。
- 主要证据
- 在LPS诱导的内毒素血症小鼠中，SRT2104降低PKM2水平并激活自噬（LC3B-II升高，p62降低），同时减轻炎症、器官损伤和改善生存率；使用自噬抑制剂3-MA或溶酶体抑制剂BafA1可逆转这些效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种通过促进PKM2自噬降解来降低PKM2丰度，从而减弱危重症中代谢与炎症协同作用的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
SIRT1激活剂干预
验证SIRT1激活剂对PKM2和自噬的影响
在LPS前30分钟腹腔注射SRT2104（25 mg/kg），检测肺组织SIRT1、LC3B-II、p62和PKM2水平，以及AMPK/mTOR通路蛋白。
自噬诱导剂对照实验
验证自噬激活是否单独导致PKM2降低
在LPS前30分钟腹腔注射雷帕霉素（5 mg/kg），检测LC3B-II、p62和PKM2水平。
评估炎症和器官损伤
评估SRT2104对炎症反应和多器官损伤的影响
在LPS后8小时收集血清和肺组织，检测炎症因子（TNF-α、IL-6、MCP-1、CXCL1、CXCL2）、MPO、BUN、BNP、细胞外DNA，并进行肺组织HE染色和临床评分。
生存分析
评估SRT2104对致死性内毒素血症小鼠生存率的影响
记录小鼠7天生存情况，绘制Kaplan-Meier生存曲线。
自噬抑制和溶酶体抑制实验
验证SRT2104对PKM2的降解是否依赖自噬和溶酶体
在SRT2104注射前30分钟，给予3-MA（15 mg/kg）或BafA1（1 mg/kg），检测PKM2、LC3B-II、p62水平及炎症指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 脂多糖（LPS, O55:B4） | Sigma-Aldrich | 01473370 |
| 药物处理 | SRT2104 | Beyotime Biotech | SC0272 |
| 3-甲基腺嘌呤（3-MA） | Med Chem Express | HY-19312 | |
| 巴弗洛霉素A1（BafA1） | Med Chem Express | HY-100558 | |
| 雷帕霉素 | Med Chem Express | S1842 | |
| 生化检测 | 血尿素氮检测试剂盒 | Nanjing Jianchen Bioengineering Institute | C013-2-1 |
| 双链DNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | Q33263 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| Western blot | 增强化学发光试剂 | Thermo Fisher Scientific | WP20005 |
| RT-qPCR | Evo M-MLV混合试剂盒 | Accurate Biology | AG11728 |
| SYBR Green预混Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology Company | EMC102a |
| IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology Company | EMC004.96 | |
| MCP-1 ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology Company | EMC113.96 | |
| CXCL1 ELISA试剂盒 | Multi Sciences Biotech | EK296/2-96 | |
| CXCL2 ELISA试剂盒 | Multi Sciences Biotech | CK2142/2-96 | |
| 髓过氧化物酶（MPO）ELISA试剂盒 | Multi Sciences Biotech | EK2133/2-96 | |
| BNP ELISA试剂盒 | USCN Business | -- | |
| Western blot | AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2603 |
| 磷酸化AMPK抗体 | Cell Signaling Technology | 2535 | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2983 | |
| 磷酸化mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 5536 | |
| PKM2抗体 | Cell Signaling Technology | 4053 | |
| HRP标记抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记抗鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| SIRT1抗体 | Beyotime Biotech | AF0282 | |
| S6K1抗体 | Beyotime Biotech | AF0258 | |
| 磷酸化S6K1抗体 | Beyotime Biotech | AF5889 | |
| 4EBP1抗体 | Beyotime Biotech | AG1824 | |
| 磷酸化4EBP1抗体 | Beyotime Biotech | AF5806 | |
| LC3B抗体 | Beyotime Biotech | AF5225 | |
| p62抗体 | Proteintech | 18420-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | 4A Biotech | 4ab000001 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Takara | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 动物实验 | 小鼠直肠温度计 | Zhongjiao | -- |
| 组织病理学 | 光学显微镜 | Olympus | -- |
| qPCR | 7300实时荧光定量PCR系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 内毒素血症模型 | LPS剂量：10 mg/kg，腹腔注射；小鼠品系：C57BL/6J；年龄6-8周，体重20-22克；检测时间点：LPS后8小时。 阅读提示：见Materials and methods中动物实验方案及图1图注。 |
| SIRT1激活剂干预 | SRT2104剂量：25 mg/kg，腹腔注射，LPS前30分钟；溶解于DMSO；检测时间点：LPS后8小时。 阅读提示：见Materials and methods动物实验方案及图1图注。 |
| 自噬抑制和溶酶体抑制 | 3-MA剂量：15 mg/kg，腹腔注射，SRT2104前30分钟；BafA1剂量：1 mg/kg，腹腔注射，SRT2104前30分钟。 阅读提示：见Materials and methods动物实验方案及图4、图6图注。 |
| 炎症和器官损伤评估 | 检测时间点：LPS后8小时；检测指标：血清TNF-α、IL-6、MCP-1、CXCL1、CXCL2、BUN、BNP、细胞外DNA；肺组织MPO、HE染色。 阅读提示：见Materials and methods中ELISA、定量RT-PCR、组织病理学及图2、图3图注。 |
| 生存分析 | 监测时间：每6小时记录一次，持续7天；样本量：n=20/组。 阅读提示：见Materials and methods中生存分析及图3K。 |
| Western blot | 抗体稀释度：AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、4EBP1、p-4EBP1、p62、LC3B、PKM2均为1:1000；β-actin为1:4000；二抗稀释度：1:4000；内参：β-actin。 阅读提示：见Materials and methods中Western blot分析及图1图注。 |
| RT-qPCR | 引物序列见表2；使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit；内参：GAPDH。 阅读提示：见Materials and methods中定量RT-PCR分析及表2。 |