虚拟筛选
从麻黄中筛选可能阻断S-RBD与ACE2相互作用的活性成分
使用Discovery Studio 4.0将麻黄中的化合物对接至S-RBD-ACE2复合物晶体结构（PDB id=6M0J）的结合位点，通过Libdock和CDOCKER协议筛选。
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伪麻黄碱及其衍生物通过阻断病毒入侵和抗炎作用拮抗野生型和突变型严重急性呼吸综合征冠状病毒2
Pseudoephedrine and its derivatives antagonize wild and mutated severe acute respiratory syndrome-CoV-2 viruses through blocking virus invasion and antiinflammatory effect.
实验完整度
中包含虚拟筛选、NanoBiT结合实验、抗炎活性检测及计算模拟，但缺乏直接病毒入侵或动物模型验证。
主要模型
HEK293细胞 Raw264.7细胞
重点核对
化合物对S-RBD/ACE2相互作用的抑制活性（NanoBiT实验） 化合物对HEK293细胞和Raw264.7细胞的细胞毒性 LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型中IL-6和TNF-α的表达水平 NF-κB和MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平
摘要
2019冠状病毒病已在全球感染超过1.5亿人，并导致超过300万人死亡。据报道，严重急性呼吸综合征（SARS）‐CoV‐2谱系B.1.1.7、B.1.617、B.1.351和P.1的感染率高于野生型。这些突变发生在刺突蛋白受体结合域（S‐RBD）中，尤其是N501Y、E484Q、E484K、K417N、K417T和L452R突变。目前，仍没有针对该病毒的特效药；此外，细胞因子风暴也是重症患者的一个危险因素。在本研究中，通过虚拟筛选发现了中药麻黄（Ephedra sinica Stapf）中潜在的靶向S‐RBD的活性单体。采用NanoBiT试验确认筛选出的化合物对SARS‐CoV‐2 S‐RBD与血管紧张素转换酶2（ACE2）相互作用的阻断活性。我们进一步通过计算研究分析了活性化合物对突变型S‐RBD与ACE2相互作用的阻断效果。此外，使用qRT‐PCR、酶联免疫吸附试验和Western blot分析评估了抗炎活性。结果，伪麻黄碱（MHJ‐17）及其衍生物（MHJ‐11）被发现是破坏ACE2与野生型和突变型S‐RBD相互作用的高效抑制剂。此外，它们还具有抗炎活性，可作为进一步研究的潜在候选药物或先导化合物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 麻黄中的活性成分是否能阻断SARS-CoV-2 S-RBD与ACE2的相互作用，并具有抗炎活性，从而对抗野生型和突变型病毒？
- 核心机制
- 伪麻黄碱（MHJ-17）及其衍生物（MHJ-11）通过阻断S-RBD与ACE2的相互作用来抑制病毒入侵，并通过抑制NF-κB和MAPK信号通路来减轻炎症反应。
- 主要证据
- NanoBiT实验显示MHJ-17和MHJ-11能剂量依赖性地抑制S-RBD/ACE2相互作用；分子对接预测它们也能阻断突变型S-RBD与ACE2的相互作用；在LPS激活的RAW264.7细胞中，它们降低IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平，并抑制NF-κB p65、p44/42 MAPK、SAPK/JNK、p38和IκBα的磷酸化。
- 研究意义
- MHJ-11和MHJ-17可作为对抗SARS-CoV-2感染的多靶点抑制剂或先导化合物，用于进一步研究和开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
NanoBiT结合实验
验证虚拟筛选得到的化合物能否阻断S-RBD与ACE2的相互作用
将S-RBD-LgBiT和SmBiT-ACE2融合质粒共转染至HEK293细胞，加入不同浓度的化合物孵育，测定发光信号，计算抑制率。
同源建模与蛋白质-蛋白质对接
构建突变型S-RBD模型并预测其与ACE2的结合模式
使用B.1.1.7和B.1.617的S-RBD序列，以野生型S-RBD-ACE2复合物（PDB id=6M0J和6ZGG）为模板进行同源建模，然后用ZDOCK和RDOCK进行蛋白-蛋白对接。
分子对接
评估MHJ-11和MHJ-17是否能阻断突变型S-RBD与ACE2的相互作用
将MHJ-11和MHJ-17对接至B.1.1.7、B.1.617、B.1.351和P.1 S-RBD与ACE2的复合物模型中，分析相互作用。
抗炎活性检测
评估MHJ-11和MHJ-17的抗炎作用
用LPS激活RAW264.7细胞，加入不同浓度的MHJ-11或MHJ-17，检测IL-6和TNF-α的mRNA和蛋白水平，以及NF-κB和MAPK通路蛋白的磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与转染 | FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- |
| 细胞培养 | Opti-MEM培养基 | Gibco-BRL/Invitrogen | -- |
| NanoBiT检测 | Nano-Glo活细胞检测试剂 | -- | -- |
| EnVision读板仪 | Perkin Elmer | -- | |
| 细胞活性检测 | MTT | -- | -- |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Sangon Biotech | -- |
| PrimeScript RT试剂盒 | TaKaRa | -- | |
| TB Green Premix Ex Taq | TaKaRa | -- | |
| ELISA | IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- |
| TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| Western blot | NP40裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 抗磷酸化NFκB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4376 | |
| 抗磷酸化SAPK/JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 | |
| Azure c600成像系统 | Azure Biosystem | -- | |
| 数据统计 | GraphPad Prism 8.0.1 | -- | -- |
| 分子模拟 | Discovery Studio 4.0 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| NanoBiT结合实验 | HEK293细胞转染效率、化合物浓度梯度、孵育时间、检测方法 阅读提示：Methods 2.5 NanoBiT-based SARS-CoV-2 S-RBD/ACE2 binding assay |
| 细胞活性检测 | Raw264.7细胞处理浓度、处理时间、MTT浓度 阅读提示：Methods 2.6 Cell viability assays |
| qRT-PCR | LPS浓度、化合物浓度、处理时间、引物序列、内参基因 阅读提示：Methods 2.7 qRT-PCR assays |
| ELISA | LPS浓度、化合物浓度、处理时间、检测试剂盒 阅读提示：Methods 2.8 Enzyme-linked immune sorbent assays |
| Western blot | LPS浓度、化合物浓度、处理时间、抗体信息、重复数 阅读提示：Methods 2.9 Western blot |