单细胞转录组图谱构建
描述鼻息肉中中性粒细胞的异质性和转录状态。
整合来自GEO、GSA和本研究测序的22个样本（5个PB、7个neCRSwNP、10个eCRSwNP）的scRNA-seq数据，注释细胞类型，并重点分析9,735个中性粒细胞。
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鼻息肉中的中性粒细胞表现出依赖于局部息肉微环境的转录适应和促炎作用
Neutrophils in nasal polyps exhibit transcriptional adaptation and proinflammatory roles that depend on local polyp milieu.
实验完整度
高整合多个公共及自身scRNA-seq数据，结合流式、免疫组化、ELISA、体外细胞刺激实验，形成多层级验证。
主要模型
鼻息肉组织中性粒细胞（eCRSwNP和neCRSwNP） 健康供体外周血中性粒细胞 人鼻上皮细胞（HNECs） 人成纤维细胞
重点核对
中性粒细胞亚群鉴定：基于scRNA-seq，使用5个功能亚群（S100A8+, GBP5+, CXCL8+, EPHB1+, S100A12+）的标记基因。 OSM刺激浓度：10 ng/mL，用于体外刺激HNECs和成纤维细胞。 IL-13和IL-17A刺激浓度：10 ng/mL，与OSM联合或单独刺激。 中性粒细胞刺激条件：LPS (10 μg/mL)、G-CSF (25 ng/mL)、GM-CSF (25 ng/mL) 刺激4小时。 OSM蛋白水平检测：通过ELISA检测组织匀浆和细胞培养上清。
摘要
慢性鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）是一种炎症性上呼吸道疾病，根据嗜酸性粒细胞水平分为嗜酸性CRSwNP（eCRSwNP）和非嗜酸性CRSwNP（neCRSwNP）。中性粒细胞是CRSwNP中的主要效应细胞，但其在不同炎症环境中的作用仍不清楚。我们对CRSwNP患者息肉浸润的中性粒细胞进行了整合转录组分析，并以健康供体血液作为对照。此外，还进行了流式细胞术和体外上皮细胞及成纤维细胞培养等实验，以评估中性粒细胞在CRSwNP中的表型特征和功能作用。单细胞RNA测序分析表明，中性粒细胞可分为5个功能亚群，其中GBP5+中性粒细胞主要出现在neCRSwNP中，而CXCL8+中性粒细胞在两种亚型中均占较高比例。GBP5+中性粒细胞在neCRSwNP中表现出显著的IFN-I通路活性。CXCL8+中性粒细胞表现出更高的中性粒细胞活化评分，并主要分泌抑瘤素M（OSM），促进与其他细胞的通讯。体外实验表明，OSM增强了鼻上皮细胞和成纤维细胞中IL-13或IL-17介导的免疫反应。我们的研究结果表明，中性粒细胞在暴露于息肉组织时表现出转录可塑性和活化，通过释放OSM与上皮细胞和成纤维细胞相互作用，从而促进CRSwNP的发病，具体机制取决于炎症环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在CRSwNP的不同炎症亚型（eCRSwNP和neCRSwNP）中，中性粒细胞的表型、功能及致病机制是否存在差异？
- 核心机制
- 中性粒细胞在鼻息肉微环境中发生转录适应，CXCL8+中性粒细胞分泌OSM，OSM通过增强IL-13介导的免疫反应（在eCRSwNP中）或IL-17A介导的免疫反应（在neCRSwNP中）来放大炎症。
- 主要证据
- scRNA-seq鉴定出5个中性粒细胞亚群，其中CXCL8+和GBP5+亚群在息肉中富集；流式细胞术证实中性粒细胞活化（CD62L下调）；体外实验显示OSM增强IL-13诱导的CCL26和periostin产生（成纤维细胞）以及IL-17A诱导的G-CSF和IL-8产生（成纤维细胞和HNECs）。
- 研究意义
- 该研究揭示了中性粒细胞在CRSwNP中的异质性和促炎作用，表明OSM作为中性粒细胞与上皮细胞和成纤维细胞通讯的关键介质，可能成为CRSwNP治疗的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中性粒细胞活化状态验证
验证鼻息肉中中性粒细胞是否处于活化状态。
通过scRNA-seq分析中性粒细胞活化通路评分和炎症小体通路评分，并使用免疫组化、ELISA和流式细胞术检测NE表达和CD62L下调。
中性粒细胞亚群鉴定和特征分析
识别鼻息肉中中性粒细胞的转录亚群及其在CRSwNP亚型中的分布。
基于DEGs将中性粒细胞分为10个簇，结合Ro/e分析鉴定5个功能亚群（S100A8+, GBP5+, CXCL8+, EPHB1+, S100A12+），分析各亚群的活化和衰老评分、IFN-I通路活性。
亚群在不同炎症背景下的转录差异
比较eCRSwNP和neCRSwNP中不同中性粒细胞亚群的转录特征。
分析每个亚群在不同亚型中的DEGs，并验证CXCR1和CXCR2的表达差异（流式细胞术）。
OSM表达和细胞通讯分析
探究中性粒细胞与其他细胞类型之间的通讯，特别是OSM信号。
使用CellChat分析细胞通讯，发现中性粒细胞是OSM的主要来源，靶细胞为成纤维细胞、上皮细胞和内皮细胞；ELISA检测组织中OSM蛋白水平；体外刺激中性粒细胞验证LPS和GM-CSF对OSM的诱导作用。
OSM对靶细胞的体外功能验证
验证OSM对上皮细胞和成纤维细胞炎症反应的影响，并区分eCRSwNP和neCRSwNP的机制差异。
用OSM单独或联合IL-13或IL-17A刺激HNECs和成纤维细胞，检测CCL26、periostin、G-CSF、IL-8的分泌以及IL-13受体和IκBζ的表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞样本制备 | MACS组织保存液 | Miltenyi Biotec | 130-100-008 |
| gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 40μm尼龙细胞筛网 | Falcon | -- | |
| 红细胞裂解液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 单细胞测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒3.1版 | 10× Genomics | -- |
| Chromium单细胞控制器 | 10× Genomics | -- | |
| Dynabeads MyOne硅烷磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina测序平台（HiSeq X Ten） | Illumina | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗NE抗体 | Abcam | ab131260 |
| 免疫荧光 | 抗OSMR抗体 | Proteintech | 10982-1-AP |
| 抗VWF抗体 | Abcam | ab6994 | |
| 抗E-CAD抗体 | Cell Signaling Technology | 3195s | |
| 抗COL1A1抗体 | Cell Signaling Technology | 72026s | |
| RNA提取 | RNA快速提取试剂盒（组织/细胞） | Tiangen Biotech | DP451 |
| 逆转录 | PrimeScript逆转录预混试剂盒 | TaKaRa | RR036 |
| RT-qPCR | SYBR预混液 | Takara | RR820 |
| ELISA | ECP ELISA试剂盒 | MBL | 7618E |
| G-CSF ELISA试剂盒 | Boster | EK0360 | |
| IL-8 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EHC008.96 | |
| Periostin ELISA试剂盒 | Boster | EK0985 | |
| CCL26 ELISA试剂盒 | R&D Systems | DY347 | |
| 人细胞因子/趋化因子Panel II试剂盒 | Millipore | -- | |
| 中性粒细胞分离 | Ficoll-Hypaque密度梯度离心 | -- | -- |
| CD16微磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-045-701 | |
| 细胞刺激 | 粒细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-23 |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | 300-03 | |
| 脂多糖 | Invitrogen | tlrl-eblps | |
| 抑瘤素M | R&D Systems | 8475-OM | |
| 白细胞介素-17A | R&D Systems | 317-ILB-050 | |
| 白细胞介素-13 | R&D Systems | 213-ILB-010 | |
| 流式细胞术 | FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞样本制备 | 组织解离条件：使用1 mg/mL胶原酶I和30 μg/mL DNase I，机械解离30分钟；红细胞裂解和死细胞去除步骤。 阅读提示：详见Methods部分 'Preparation of single-cell suspensions' |
| 单细胞测序 | 建库试剂盒：Chromium Next GEM Single Cell 3' Reagent Kit version 3.1；测序平台：Illumina HiSeq X Ten；数据处理参数：force-cells和include-introns选项。 阅读提示：详见Methods部分 'scRNA-seq data' 和 'scRNA-seq data preprocessing and quality control' |
| 中性粒细胞活化验证 | 流式抗体：anti-CD45, -CD66B, -CD16, -CD62L；样本量：PB n=19, neCRSwNP n=10, eCRSwNP n=11。 阅读提示：详见Methods部分 'Flow cytometric analysis of PB and NP tissue' 和 Figure 2 legend |
| OSM体外刺激 | 刺激浓度：OSM 10 ng/mL, IL-13 10 ng/mL, IL-17A 10 ng/mL；刺激时间：12或24小时；细胞类型：HNECs和成纤维细胞。 阅读提示：详见Methods部分 'Isolation and in vitro cell stimulation' 和 Figure 6 legend |