细胞模型建立与铁死亡表型鉴定
验证高草酸盐能否诱导HK-2细胞铁死亡及其剂量依赖性
使用不同浓度草酸钠处理HK-2细胞，检测细胞活力、氧化应激、铁代谢及铁死亡相关蛋白表达。
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Hippo-YAP1/TEAD1-SLC7A5轴：揭示草酸盐诱导肾小管铁死亡的新型治疗靶点
The hippo-YAP1/TEAD1-SLC7A5 axis: uncovering a novel therapeutic target for oxalate-induced renal tubular ferroptosis.
实验完整度
高包含细胞模型（HK-2）和动物模型（乙醛酸盐诱导小鼠）两个独立证据层级，并包含功能验证（过表达/敲低、药物干预）和机制验证（ChIP-qPCR、双荧光素酶报告基因）
主要模型
HK-2细胞 HEK-293T细胞 乙醛酸盐诱导的草酸盐肾病小鼠模型
重点核对
HK-2细胞暴露于不同浓度草酸钠（1、2、3 mM）24小时 乙醛酸盐注射剂量（50或100 mg/kg）及给药方式（腹腔注射，每日一次，共7天） Ferrostatin-1（1 μM）和Verteporfin（1 μM）等抑制剂浓度 YAP1、SLC7A5过表达或敲低的稳定转染细胞系筛选浓度（5 μg/ml嘌呤霉素） TEAD1 siRNA浓度（100 nmol/L）及转染试剂
摘要
目的：系统研究高草酸盐应激下肾小管上皮细胞铁死亡的调控机制，重点识别关键上游信号通路及其治疗潜力。方法：采用HK-2细胞培养和乙醛酸盐诱导的草酸盐肾病小鼠模型。整合4D无标记蛋白质组学、RNA测序和CUT&Tag等多组学方法以识别调控网络。功能验证采用基因操作、药理学干预、染色质免疫沉淀和双荧光素酶报告基因实验。结果：高草酸盐剂量依赖性地诱导肾小管铁死亡并激活Hippo通路，导致YAP1磷酸化和失活。蛋白质组学和多组学分析确定YAP1为关键调控因子，SLC7A5为其通过TEAD1的直接转录靶标。高草酸盐破坏YAP1/TEAD1与SLC7A5启动子的结合，下调SLC7A5。功能挽救实验证实，在YAP1抑制下，SLC7A5缺失介导铁死亡。机制上，SLC7A5下调限制亮氨酸可用性并抑制mTOR信号，而亮氨酸补充或mTOR再激活可逆转铁死亡，表明SLC7A5通过亮氨酸/mTOR轴调控铁死亡。结论：我们确定Hippo-YAP1/TEAD1-SLC7A5轴是控制草酸盐诱导铁死亡的主调控通路。该通路代表了草酸盐肾病有前景的治疗靶点，并为肾脏疾病中应激反应性铁死亡调控提供了基础见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 高草酸盐应激如何通过上游信号通路调控肾小管上皮细胞铁死亡，以及该通路是否具有治疗潜力。
- 核心机制
- 高草酸盐激活Hippo通路，导致YAP1磷酸化并抑制其核转位，进而减少YAP1/TEAD1复合物与SLC7A5启动子的结合，抑制SLC7A5转录，限制亮氨酸转运和mTOR信号，最终诱导铁死亡。
- 主要证据
- 通过HK-2细胞和乙醛酸盐诱导小鼠模型，结合蛋白质组学、RNA-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验，验证了YAP1/TEAD1调控SLC7A5及亮氨酸/mTOR轴在铁死亡中的关键作用。
- 研究意义
- 该研究首次阐明Hippo-YAP1/TEAD1-SLC7A5轴在草酸盐诱导铁死亡中的因果作用，为草酸盐肾病及相关肾脏疾病的治疗提供了潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物模型建立与表型分析
验证乙醛酸盐诱导的小鼠肾损伤是否通过铁死亡机制
给予小鼠乙醛酸盐注射，检测肾功能、组织病理、铁死亡标志物及晶体沉积。
蛋白质组学筛选关键调控因子
识别高草酸盐诱导铁死亡的关键上游调控蛋白
对草酸钠处理的HK-2细胞进行4D无标记蛋白质组学分析，并与铁死亡数据库交叉对比。
YAP1功能验证
验证YAP1在高草酸盐诱导铁死亡中的保护作用
过表达或敲低YAP1后检测铁死亡表型及相关蛋白表达。
Hippo通路激活验证
验证高草酸盐是否通过激活Hippo通路抑制YAP1核转位
Western blot检测LATS1和YAP1磷酸化水平，细胞核/质分离和免疫荧光分析YAP1定位。
机制研究：YAP1下游靶标鉴定
识别YAP1调控的与铁死亡相关的下游靶基因
通过CUT&Tag和RNA-seq整合分析，筛选YAP1结合基因和差异表达基因。
转录调控验证
验证YAP1/TEAD1复合物调控SLC7A5转录的分子机制
ChIP-qPCR检测YAP1在SLC7A5启动子结合，TEAD1敲低实验和双荧光素酶报告基因实验验证TEAD1结合位点。
代谢机制验证：SLC7A5-亮氨酸-mTOR轴
验证SLC7A5通过亮氨酸转运和mTOR信号调控铁死亡
敲低SLC7A5或补充亮氨酸、使用mTOR抑制剂处理HK-2细胞，检测铁死亡表型。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Servicebio | G4612 |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| 药物处理 | 铁死亡抑制剂Ferrostatin-1 | MedChemExpress | HY-100579 |
| 维替泊芬 | MedChemExpress | HY-B0146 | |
| XMU-MP-1 | MedChemExpress | HY-100526 | |
| 坏死性凋亡抑制剂Necrostatin-1 | MedChemExpress | HY-15760 | |
| 凋亡抑制剂Z-VAD-FMK | MedChemExpress | HY-16658B | |
| L-亮氨酸 | MedChemExpress | HY-N0486 | |
| AZD-8055 | MedChemExpress | HY-10422 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000015 |
| 嘌呤霉素 | Servicebio | G4017 | |
| 生化检测 | CCK-8试剂盒 | Boster | AR1160 |
| LDH检测试剂盒 | Servicebio | G1610 | |
| MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131 | |
| GSH检测试剂盒 | Solarbio | BC1175 | |
| 细胞内亚铁离子检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M | |
| DCFH-DA探针 | Servicebio | G1706 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Boster | AR0102S |
| 核浆蛋白提取试剂盒 | Solarbio | EX1470 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Boster | AR1189 | |
| PVDF膜 | Merck-Millipore | IPVH00010 | |
| 快速封闭液 | Boster | AR0041 | |
| TBST缓冲液 | Servicebio | G2150 | |
| ECL化学发光试剂 | Boster | AR1171 | |
| GelView 6000 Pro化学发光成像系统 | Biolight | -- | |
| 动物实验 | 乙醛酸盐 | Sigma | G10601 |
| Ferrostatin-1 | MedChemExpress | -- | |
| 生化检测（血液和组织） | 血清肌酐检测试剂盒 | Biobase | -- |
| 尿素氮检测试剂盒 | Biobase | -- | |
| 生化检测（组织） | MDA检测试剂盒 | Solarbio | BC0025 |
| 亚铁离子检测试剂盒 | Solarbio | BC5415 | |
| 组织学 | Von Kossa染色 | -- | -- |
| 光学显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 光学显微镜 | Olympus | -- | |
| RNA提取与测序 | RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP432 |
| Qsep400系统 | -- | -- | |
| RNA-seq | VAHTS mRNA-seq V8文库制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| 逆转录试剂盒 | Vazyme | R433 | |
| SYBR Green预混液 | Yeasen | 11202ES | |
| QuantStudio 6系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ChIP-qPCR | ChIP检测试剂盒 | Beyotime | P2080S |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Beyotime | RG029 |
| 细胞转染 | EZ Trans慢病毒感染试剂盒 | Life-iLab | AC04L6 |
| 蛋白质组学 | Q Exactive HF-X质谱仪 | -- | -- |
| CUT&Tag | ChiTag™转座酶 | -- | -- |
| Qubit 4.0荧光计 | -- | -- | |
| QSep400系统 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | HK-2细胞培养条件、草酸钠浓度（1、2、3 mM）及处理时间（24小时）、抑制剂浓度 阅读提示：Methods: Cell Culture and Treatment |
| 细胞转染 | 慢病毒转染和siRNA转染的具体条件、筛选浓度（5 μg/ml嘌呤霉素）、siRNA浓度（100 nM） 阅读提示：Methods: Cell Transfection |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、分组及样本量、乙醛酸盐剂量（50/100 mg/kg）、给药方式（腹腔注射）和时间（7天）、Ferrostatin-1和Verteporfin剂量（10 mg/kg）及给药时间点 阅读提示：Methods: Animal Experiments |
| 分子机制验证 | ChIP-qPCR中使用的抗体、引物序列、TEAD1敲低条件、双荧光素酶报告基因实验的细胞系和转染条件 阅读提示：Methods: Quantitative Real-Time PCR (RT-qPCR) and Chromatin Immunoprecipitation-qPCR (ChIP-qPCR), Dual-Luciferase Reporter Assay |
| 多组学分析 | 蛋白质组学、RNA-seq、CUT&Tag的样本处理、测序平台和数据获取方式 阅读提示：Methods: Proteomic Profiling, RNA-seq, CUT&Tag |