临床样本中LILRB4表达及与免疫抑制相关性分析
检测LILRB4在宫颈癌组织中的表达及其与免疫抑制指标的关系
对29例新鲜CC及癌旁组织进行mRNA-seq和qPCR，检测LILRB4、GZMB、PD-1、CTLA-4表达；对49例石蜡包埋标本进行IHC染色，分析LILRB4高表达与CD8、CD4、CD11b表达及临床病理特征相关性。
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LILRB4通过肿瘤浸润性髓系细胞扩增和CD8+ T细胞抑制塑造免疫抑制微环境驱动宫颈癌进展
LILRB4 shapes an immunosuppressive microenvironment to drive cervical cancer progression through tumor-infiltrating myeloid cell expansion and CD8+ T-cell suppression.
实验完整度
高包含临床样本转录组分析、免疫组化、小鼠肿瘤模型、流式细胞术、共培养实验、Co-IP和荧光素酶报告基因等，涵盖体外和体内功能验证。
主要模型
人宫颈癌组织及癌旁组织 U14小鼠宫颈癌细胞系皮下移植瘤模型 小鼠脾脏CD8+ T细胞和骨髓来源巨噬细胞
重点核对
LILRB4在人宫颈癌组织中的表达及与免疫抑制基因的相关性 抗LILRB4抗体处理对U14移植瘤生长的影响 抗LILRB4抗体处理后肿瘤内CD8+ T细胞功能指标（IFN-γ、TNF-α、Ki67等） 抗LILRB4抗体处理后肿瘤内髓系细胞（M2-TAMs、MDSCs）比例变化 HPV16 E6/E7对ApoE转录和表达的影响
摘要
宫颈癌(CC)是最常见的妇科恶性肿瘤，与人乳头瘤病毒(HPV)感染密切相关。目前，免疫检查点阻断疗法对CC的临床获益有限，凸显了寻找更有效治疗靶点的必要性。LILRB4是白细胞免疫球蛋白样受体超家族成员，被认为是癌症免疫抑制的关键介质。然而，其在CC免疫微环境中的作用仍不清楚。本研究中，LILRB4在CC组织中表达上调，高表达水平与肿瘤晚期及免疫抑制基因呈正相关。在免疫功能正常的小鼠模型中，CC肿瘤中LILRB4的表达随肿瘤生长而增加，而阻断LILRB4可减少肿瘤生长。流式细胞术分析显示，阻断LILRB4减少了肿瘤内CD8+ T细胞的耗竭。此外，阻断LILRB4减少了肿瘤浸润性髓系细胞(TIMs)的数量，包括髓源性抑制细胞(MDSCs)和M2肿瘤相关巨噬细胞(M2-TAMs)。细胞共培养实验表明，阻断LILRB4通过减少MDSCs和TAMs的数量来阻止CD8+ T细胞耗竭。此外，HPV16通过转录调控上调ApoE表达，LILRB4介导了ApoE对CD8+ T细胞的抑制。总体而言，HPV16/ApoE/LILRB4轴诱导TIM介导的CD8+ T细胞抑制，形成促进CC进展的免疫抑制微环境。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- LILRB4在宫颈癌免疫微环境中的作用及其机制是什么？
- 核心机制
- HPV16通过转录调控上调ApoE表达，ApoE与LILRB4相互作用，介导TIMs对CD8+ T细胞的抑制，形成免疫抑制微环境促进宫颈癌进展。
- 主要证据
- 人宫颈癌组织中LILRB4表达升高且与免疫抑制相关；在小鼠U14肿瘤模型中，阻断LILRB4减少肿瘤生长、CD8+ T细胞耗竭及TIMs数量；共培养实验证明LILRB4阻断减弱TIMs的免疫抑制能力；Co-IP和荧光素酶实验证明ApoE与LILRB4相互作用且HPV16 E6/E7上调ApoE表达。
- 研究意义
- 该研究提出LILRB4作为宫颈癌的预后标志物和治疗靶点，支持将LILRB4阻断与现有免疫检查点抑制剂联合的探索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠肿瘤模型中LILRB4表达及功能验证
验证LILRB4在小鼠肿瘤中的表达变化，并评估阻断LILRB4对肿瘤生长的影响
C57BL/6小鼠皮下接种U14细胞，检测不同时间点肿瘤中LILRB4表达；给予抗LILRB4抗体或同型对照，测量肿瘤体积和重量。
流式细胞术分析肿瘤内CD8+ T细胞和髓系细胞变化
评估LILRB4阻断对CD8+ T细胞功能及髓系细胞比例的影响
取肿瘤组织制备单细胞悬液，进行流式染色，检测CD8+ T细胞中Ki67、IFN-γ、TNF-α、Granzyme B、PD-1、CTLA-4表达，以及M2-TAMs（CD163+）和MDSCs（Gr1+）比例。
体外共培养实验验证LILRB4对CD8+ T细胞及髓系细胞免疫抑制功能的影响
验证LILRB4阻断是否直接或间接影响CD8+ T细胞功能
分离小鼠脾脏CD8+ T细胞，用抗LILRB4或同型抗体处理，检测CD8+ T细胞功能指标；将抗LILRB4处理的MDSCs、BMDMs与CD8+ T细胞共培养，检测CD8+ T细胞增殖和细胞因子产生；用ApoE蛋白处理CD8+ T细胞，观察LILRB4阻断的效果。
机制研究：HPV16调控ApoE及ApoE与LILRB4相互作用
阐明HPV16、ApoE和LILRB4之间的分子机制
使用Co-IP检测ApoE与LILRB4相互作用；在HPV16阳性SiHa细胞中敲低E6/E7，检测ApoE mRNA和蛋白水平；用双荧光素酶报告基因检测ApoE启动子活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Servicebio | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 动物实验 | 抗LILRB4单克隆抗体 | Thermo Scientific | 16-5784-85 |
| 同型对照抗体 | Thermo Scientific | 16-4888-81 | |
| 细胞分选 | MagniSort™小鼠CD8 T细胞富集试剂盒 | Thermo Scientific | -- |
| 细胞培养 | 抗CD3抗体 | Thermo Scientific | -- |
| 抗CD28抗体 | Thermo Scientific | -- | |
| 小鼠白细胞介素-2 | MedChemExpress | -- | |
| 细胞死活去除 | MojoSort™小鼠死细胞去除试剂盒 | BioLegend | -- |
| 流式分析 | PE标记抗CD85k单克隆抗体 | Thermo Scientific | 12-5784-80 |
| PerCP标记抗小鼠CD45抗体 | Elabscience | E-AB-F1136F | |
| APC标记抗小鼠CD3抗体 | Elabscience | E-AB-F1013E | |
| PE标记抗小鼠CD8a抗体 | Elabscience | E-AB-F1104D | |
| Alexa Fluor™ 488标记Ki-67单克隆抗体 | Thermo Scientific | 53-5698-80 | |
| FITC标记抗小鼠IFN-γ抗体 | Elabscience | E-AB-F1101UC | |
| FITC标记抗TNF-α单克隆抗体 | Thermo Scientific | 11-7321-41 | |
| PE标记抗小鼠/人CD11b抗体 | Elabscience | E-AB-F1081D | |
| FITC标记抗小鼠F4/80抗体 | Elabscience | E-AB-F0995C | |
| APC标记抗小鼠CD163抗体 | Elabscience | E-AB-F1295E | |
| FITC标记抗小鼠Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)抗体 | Elabscience | E-AB-F1120C | |
| FITC标记granzyme B单克隆抗体 | Thermo Scientific | 11-8898-82 | |
| FITC标记抗小鼠CD279/PD-1抗体 | Elabscience | E-AB-F1131C | |
| 抗CTLA-4抗体 | BioLegend | 106315 | |
| 细胞增殖标记 | CFSE | MACKLIN | -- |
| 细胞内细胞因子刺激 | 佛波醇12-豆蔻酸酯13-乙酸酯 | MACKLIN | -- |
| 离子霉素 | MACKLIN | -- | |
| 布雷菲德菌素A | MACKLIN | -- | |
| 细胞处理 | 脂多糖 | -- | -- |
| 重组ApoE蛋白 | MedChemExpres | HY-P7532 | |
| RNA提取 | TRIpure试剂 | BioTeke Corporation | -- |
| RNA定量 | NanoDrop One分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| cDNA合成 | All-in-One第一链cDNA合成预混液 | Majorbio | -- |
| qPCR | Pangaea 3实时荧光定量PCR系统 | Aperbio | -- |
| 2× Fast Taq Plus PCR预混液 | Biosharp | -- | |
| SYBR Green I | Solarbio | -- | |
| 免疫共沉淀 | RIPA裂解液 | Proteintech | -- |
| Protein G磁珠 | Proteintech | -- | |
| 抗ApoE抗体 | Santa Cruz | sc-390925 | |
| 抗Flag抗体 | Zenbio | R24091 | |
| HRP标记二抗 | Proteintech | -- | |
| 超敏ECL化学发光试剂盒 | Proteintech | -- | |
| ELISA | 人APOE ELISA试剂盒 | Fine Biotech | -- |
| 荧光素酶报告基因 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 荧光素酶检测试剂盒 | KeyGEN | -- | |
| 免疫组化 | 苏木素 | Solarbio | -- |
| 抗CD4抗体 | Zenbio | R380991 | |
| 抗CD8抗体 | Affinity | AF5126 | |
| 抗CD11b抗体 | Zenbio | R380834 | |
| 抗LILRB4抗体 | Zenbio | 222848 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | CC组织与癌旁组织样本数量、LILRB4表达水平、与GZMB、PD-1、CTLA-4的相关性 阅读提示：Materials and methods: Clinical sample collection; Figure 1D-E |
| 小鼠肿瘤模型 | 小鼠品系、周龄、性别、每组数量、U14细胞接种量、注射部位、抗体剂量及给药时间 阅读提示：Materials and methods: Mice and treatment; Figure 2A, E |
| 流式分析 | 抗体克隆号及荧光标记、细胞处理条件（如PMA/离子霉素刺激）、死活去除试剂盒 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry; Figures 3,4 |
| 体外共培养 | 细胞比例、共培养时间、抗体浓度、ApoE蛋白浓度 阅读提示：Materials and methods: Cell treatment and coculture systems; Figures 5,6,7 |
| 机制研究 | Co-IP所用抗体和结合条件、siRNA转染浓度、荧光素酶报告载体 阅读提示：Materials and methods: Coimmunoprecipitation, Luciferase reporter assay; Figure 7 |