临床样本中PFKM表达分析
分析CKD患者肾组织中PFKM表达及其与纤维化标志物的相关性
对GSE175759和GSE66494数据集的RNA-seq和微阵列数据进行重新分析，检测PFKM、FN、Col3a1、PDGFB的mRNA水平，并进行相关性分析。
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糖酵解酶PFKM通过乳酸介导的H3K18乳酰化激活NF-κB通路促进肾纤维化
The glycolytic enzyme PFKM promotes renal fibrosis by activating the NF-κB pathway via lactate-mediated H3K18 lactylation.
实验完整度
高包含临床数据库分析、FA诱导小鼠模型、HK-2细胞模型、AAV9介导的基因敲低/过表达，以及RNA-seq、CUT&Tag、ChIP-qPCR等功能和机制验证。
主要模型
FA诱导的肾纤维化小鼠模型（C57BL/6J） TGF-β1刺激的HK-2细胞纤维化模型 CKD患者肾组织（GSE175759、GSE66494数据集）
重点核对
8周龄雄性C57BL/6J小鼠，FA单次腹腔注射250 mg/kg诱导肾纤维化 AAV9-KSP1.3载体介导肾小管上皮细胞特异性PFKM敲低或过表达，剂量5×10¹¹ vg/只 HK-2细胞用10 ng/mL TGF-β1刺激24小时构建纤维化模型 2-DG（糖酵解抑制剂）和BAY 11-7082（NF-κB抑制剂）用于机制验证 CUT&Tag和ChIP-qPCR用于检测Rela启动子区H3K18la富集
摘要
糖酵解重编程与慢性肾脏病（CKD）进展密切相关。然而，磷酸果糖激酶肌型（PFKM）作为糖酵解的核心限速酶，在肾纤维化中的作用和机制仍不清楚。本研究分析了CKD患者肾组织的基因表达综合（GEO）数据集，构建了叶酸（FA）诱导的肾纤维化小鼠模型。使用腺相关病毒血清型9（AAV9）载体在肾小管上皮细胞中特异性实现PFKM过表达或敲低。此外，结合转化生长因子-β1（TGF-β1）刺激的人肾-2（HK-2）细胞模型，通过组织学染色、代谢分析、核糖核酸（RNA）测序（RNA-seq）、靶向切割与标签化（CUT&Tag）和染色质免疫沉淀-定量聚合酶链反应（ChIP-qPCR）探讨了潜在机制。结果显示，PFKM在CKD患者和纤维化小鼠的肾组织中显著上调，并与纤维化标志物呈正相关。功能实验表明，PFKM敲低减轻了FA诱导的小鼠肾纤维化，而PFKM过表达加重了纤维化。机制上，PFKM驱动糖酵解重编程，导致乳酸积累。乳酸通过修饰促进Rela启动子处组蛋白H3赖氨酸18乳酰化（H3K18la），从而激活核因子-κB（NF-κB）通路，最终加重肾脏炎症和纤维化。总之，PFKM通过“糖酵解-乳酸-H3K18la-NF-κB”轴促进肾纤维化，将其确定为CKD的新治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PFKM是否通过调控糖酵解重编程及其产物乳酸介导的组蛋白乳酰化修饰来促进肾纤维化？
- 核心机制
- PFKM驱动糖酵解重编程导致乳酸积累，乳酸通过促进Rela启动子区H3K18la修饰激活NF-κB通路，从而加剧肾脏炎症和纤维化。
- 主要证据
- 基于CKD患者肾组织数据集、FA诱导小鼠模型和TGF-β1刺激的HK-2细胞模型，通过基因敲低/过表达、RNA-seq、CUT&Tag和ChIP-qPCR验证了PFKM通过“糖酵解-乳酸-H3K18la-NF-κB”轴促进肾纤维化。
- 研究意义
- 首次揭示PFKM通过代谢-表观遗传-炎症轴促进肾纤维化，为CKD提供了新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
FA诱导小鼠肾纤维化模型建立及PFKM表达动态
验证PFKM在体内肾纤维化模型中的表达变化
对8周龄雄性C57BL/6J小鼠单次腹腔注射FA（250 mg/kg）诱导肾纤维化，在诱导后0、3、5、7、14天检测PFKM mRNA和蛋白水平，并进行IHC和Sirius Red染色。
TEC特异性PFKM敲低和过表达的功能实验
验证PFKM在肾纤维化中的因果关系
使用AAV9-KSP1.3载体通过肾实质肾盂原位注射实现TEC特异性PFKM敲低（shPFKM）或过表达（OE-PFKM），2周后进行FA诱导或Vehicle对照，检测肾损伤、纤维化程度及肾功能指标。
体外TGF-β1诱导的HK-2细胞纤维化模型
验证PFKM对肾小管上皮细胞纤维化表型的影响
在HK-2细胞中敲低或过表达PFKM后，用TGF-β1刺激构建纤维化模型，检测纤维化标志物、乳酸含量及糖酵解和线粒体功能。
糖酵解重编程的机制验证
验证PFKM是否通过驱动糖酵解重编程促进纤维化
在体内和体外模型中检测糖酵解相关基因（HIF-1α、HK2、LDHA）的表达和乳酸水平，并使用Seahorse分析OCR和ECAR，通过2-DG干预验证PFKM的促纤维化作用依赖于糖酵解。
转录组分析鉴定PFKM下游通路
筛选PFKM调控的炎症和纤维化相关信号通路
对vehicle+shNC、FA+shNC和FA+shPFKM组小鼠肾组织进行RNA-seq，通过DEG分析和GSEA分析发现NF-κB通路显著下调。
NF-κB通路活性验证及炎症表型评估
验证PFKM通过NF-κB通路促进肾脏炎症
在体内和体外模型中检测NF-κB通路蛋白（p-IκBα、p-IKKα/β、p-P65）及下游炎症因子（IL-1β、TNF-α、IL-6）的表达，并使用NF-κB抑制剂BAY 11-7082验证依赖性。
H3K18la修饰及表观遗传机制验证
验证PFKM通过乳酸介导H3K18la修饰激活Rela转录
检测体内外模型中H3K18la水平，通过CUT&Tag全基因组分析H3K18la在Rela启动子区的富集，用ChIP-qPCR验证，并通过乳酸回补实验验证乳酸的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型构建 | 叶酸 | MCE | HY-16637 |
| 碳酸氢钠 | MCE | HY-Y0756 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Servicebio | G4512-500ML |
| 细胞转染 | Lipo8000™转染试剂 | Beyotime | C0533 |
| 细胞处理 | 转化生长因子-β1 | -- | -- |
| Bay11-7082 | MCE | HY-13453 | |
| 2-脱氧-D-葡萄糖 | MCE | HY-13966 | |
| 乳酸 | MCE | HY-B2227 | |
| 组织学染色 | Masson三色染色试剂盒 | Leagene | DC0032 |
| 天狼星红染色试剂盒 | Sbjbio | BP-DL030 | |
| 免疫组织化学 | DAB染色试剂盒 | Mindray | FL-6001 |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | Beyotime | C1005 |
| Alexa Fluor 488荧光二抗 | Beyotime | A0428 | |
| Alexa Fluor 555荧光二抗 | Beyotime | A0453 | |
| western blot | RIPA裂解液 | Biosharp | BL504A |
| SDS-PAGE凝胶 | Biosharp | BL502B | |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 山羊抗小鼠IgG | Zs-BIO | ZB-2305 | |
| 山羊抗兔IgG | Zs-BIO | ZB-2301 | |
| PFKM抗体 | Proteintech | 55028-1-AP | |
| α-SMA抗体 | Proteintech | 67735-1-Ig | |
| 纤连蛋白抗体 | Affinity | AF5335 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | 14472 | |
| 己糖激酶2抗体 | HUABIO | HA722933 | |
| 缺氧诱导因子1α抗体 | Affinity | AF1009 | |
| 乳酸脱氢酶A抗体 | Proteintech | 19987-1-AP | |
| IκBα抗体 | Affinity | AF5002 | |
| 磷酸化IκBα抗体 | Affinity | AF2002 | |
| IKKα/β抗体 | HUABIO | ET1611-23 | |
| 磷酸化IKKα/β抗体 | CST | 2697T | |
| p65抗体 | Affinity | AF5006 | |
| 磷酸化p65抗体 | Affinity | AF2006 | |
| 白细胞介素-1β抗体 | SciBen | 50411 | |
| 组蛋白H3抗体 | ZENBIO | 381432 | |
| H3K18la抗体 | PTMBIO | PTM-1406RM | |
| β-肌动蛋白抗体 | Zs-BIO | TA-09 | |
| 免疫组化 | F4/80抗体 | Proteintech | 29414-1-AP |
| 免疫荧光 | GFP抗体 | HUABIO | ET1607-31 |
| 水通道蛋白1抗体 | HUABIO | ET1703-34 | |
| 血清生化检测 | 血肌酐ELISA试剂盒 | Njjcbio | C011-2-1 |
| 血尿素氮ELISA试剂盒 | Njjcbio | C013-2-1 | |
| 乳酸浓度检测 | L-乳酸比色法检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K044-M |
| 代谢分析 | Seahorse XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103016-100 |
| 糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent | 103020-100 | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Life Technologies | 15596018 |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq文库构建试剂盒 | Vazyme | -- | |
| RT-qPCR | All-in-One第一链合成预混液试剂盒 | iScience | EG15133S |
| Taq SYBR Green qPCR预混液 | iScience | EG20117M | |
| CUT&Tag | 细胞核提取试剂盒 | Solarbio | SN0020 |
| pA-Tn5转座酶 | Vazyme Biotech | S603-01 | |
| ChIP-qPCR | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | 17-295 |
| 设备 | NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Seahorse XFe96细胞外通量分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| OLYMPUS CX43显微镜 | OLYMPUS | -- | |
| ECLIPSE E100荧光显微镜 | NIKON | -- | |
| Illumina NovaSeq平台 | Novogene | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 8周龄雄性C57BL/6J小鼠，FA剂量250 mg/kg单次腹腔注射，AAV9载体剂量5×10¹¹ vg/只，肾实质肾盂原位注射方式 阅读提示：详见Materials and methods中的Animal model construction and genetic intervention部分 |
| 细胞模型构建 | HK-2细胞系，TGF-β1浓度10 ng/mL，刺激时间24小时，转染试剂Lipo8000™ 阅读提示：详见Materials and methods中的Cell culture, transfection, and treatment部分 |
| 基因敲低/过表达 | AAV9-KSP1.3-GFP-shPFKM/shNC和OE-PFKM/OE-NC载体构建，转染后2周进行FA诱导 阅读提示：详见Materials and methods中的Animal model construction and genetic intervention部分 |
| 糖酵解功能分析 | Seahorse XFe96分析OCR和ECAR，使用Mito stress test kit和Glycolysis stress test kit 阅读提示：详见Materials and methods中的Measurement of extracellular OCR and ECAR部分 |
| 表观遗传分析 | CUT&Tag和ChIP-qPCR检测H3K18la在Rela启动子区的富集，每组n=3 阅读提示：详见Materials and methods中的CUT & Tag和ChIP-qPCR部分，以及Figure 8 legend |