单细胞转录组图谱构建
描绘UM肿瘤微环境的细胞组成和转录异质性
对9例原发UM样本进行单细胞RNA测序，经质控、聚类和注释，获得81,695个细胞，识别出10种主要细胞类型。
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肿瘤内源性氧化还原编程驱动葡萄膜黑色素瘤中SPP1-CD44轴的免疫抑制
Tumor-intrinsic redox programming drives an SPP1-CD44 axis of immune suppression in uveal melanoma.
实验完整度
中文献包含单细胞测序、细胞功能实验、共培养、免疫荧光等实验，但缺乏体内动物模型验证，且有体外共培养证据间接性及ROS机制未完全阐明等限制。
主要模型
葡萄膜黑色素瘤临床样本（9例原发肿瘤，5例患者） 人UM细胞系（92.1, MEL202, MEL290, OMM1, OMM2.3, MP46） 正常黑色素细胞系PIG1 CD8+ T细胞共培养体系
重点核对
UM临床样本来源：上海第九人民医院，伦理批号SH9H-2023-T462-1 单细胞RNA测序：9例原发肿瘤，81,695个细胞，质控标准（基因数200-7000，UMI 800-30000，线粒体比例<10%） SPP1过表达及rhSPP1处理：100 ng/mL重组人SPP1，10 μg/mL抗CD44抗体 Mito-LND处理浓度：5 μM，处理24小时 共培养条件：肿瘤细胞与CD8+ T细胞比例1:5，IL-2 10 ng/mL，共培养24小时
摘要
葡萄膜黑色素瘤（UM）是一种罕见但侵袭性强的恶性肿瘤，具有远处转移倾向，对全身治疗（包括免疫治疗）反应差。尽管最近的单细胞研究揭示了明显的肿瘤内异质性和免疫抑制性肿瘤微环境，但驱动免疫逃逸的肿瘤内源性代谢程序仍不清楚。在此，我们对原发性UM标本进行了单细胞RNA测序，以生成肿瘤和免疫细胞状态的高分辨率图谱。我们鉴定了一个氧化还原优化的黑色素瘤亚群，该亚群处于高代谢-蛋白质稳态需求下，以密集的蛋白质分泌活性和升高的抗氧化防御为特征。这种适应性状态是维持基质细胞蛋白SPP1稳健分泌所必需的，SPP1通过CD44结合抑制CD8+ T细胞的增殖和功能。通过线粒体靶向氧化磷酸化抑制剂增强活性氧（ROS）破坏氧化还原平衡，会触发内质网应激并下调SPP1表达，从而定义了一个直接的代谢-免疫调节轴。总之，我们的发现揭示了一个先前未识别的ROS-SPP1-CD44轴，将肿瘤氧化还原稳态与免疫逃逸联系起来，为UM的免疫抵抗表型提供了机制见解，并提示了代谢-免疫串扰中潜在的治疗脆弱性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 葡萄膜黑色素瘤中肿瘤细胞内在的代谢程序如何驱动免疫逃逸，特别是氧化还原状态如何调节SPP1分泌并抑制CD8+ T细胞功能？
- 核心机制
- ROS-SPP1-CD44轴：适度的ROS通过C/EBPβ促进SPP1转录和分泌，SPP1通过CD44抑制CD8+ T细胞增殖和功能；而过高ROS诱导内质网应激，下调SPP1表达。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定TXN+ MEL亚群高抗氧化和ER应激特征；细胞共培养实验证明SPP1抑制CD8+ T细胞增殖及IFN-γ产生，且CD44阻断可恢复；Mito-LND处理增加ROS，诱导ER应激，降低SPP1表达和分泌。
- 研究意义
- 研究揭示UM免疫抵抗的代谢-免疫轴，提示靶向氧化磷酸化或阻断SPP1-CD44可能增强抗肿瘤免疫，为联合免疫治疗提供策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
黑色素瘤细胞亚群鉴定
解析肿瘤细胞内在的转录状态和代谢特征
对33,587个黑色素瘤细胞进行再聚类，得到5个亚群，其中TXN+ MEL亚群富集于AT，具有高抗氧化、ER应激和UPR特征。
T细胞亚群分析
评估肿瘤浸润T细胞的功能状态和免疫抑制特征
对5,919个T细胞聚类，得到9个亚群，AT组中CD8+ T细胞浸润减少，Treg富集，且CD8+ T细胞呈现耗竭特征。
细胞通讯分析
鉴定肿瘤细胞与T细胞之间的关键信号通路
通过CellChat分析，发现TXN+ MEL是SPP1的主要来源，SPP1-CD44为最主要的配体-受体对，免疫荧光验证了SPP1+黑色素瘤细胞与CD8+ T细胞的空间邻近。
SPP1功能验证
验证SPP1对肿瘤细胞自身及CD8+ T细胞功能的影响
过表达SPP1或给予rhSPP1处理，检测细胞增殖、侵袭及共培养体系中CD8+ T细胞的Ki-67和IFN-γ表达；使用抗CD44抗体验证CD44依赖性。
Mito-LND处理验证代谢-免疫轴
探讨ROS扰动对SPP1表达和分泌的影响
用Mito-LND处理MP46细胞，检测细胞活力、OCR、ROS水平、SPP1表达及ER应激标志物CHOP。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单细胞悬液制备 | 组织保存液 | Miltenyi | -- |
| 40 μm细胞筛网 | Falcon | -- | |
| 红细胞裂解液 | Miltenyi | -- | |
| 自动细胞计数仪 | Logos Biosystems | Luna-FL | |
| 单细胞RNA测序 | Chromium Next GEM单细胞3'试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099141C | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15070063 | |
| Mito-LND | MCE | HY-134832 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | CK04 |
| 酶标仪 | BioTek Instruments | -- | |
| 克隆形成实验 | 结晶紫 | Sangon Biotech | E607309 |
| ImageJ软件 | NIH | -- | |
| Transwell实验 | 预包被细胞外基质蛋白的Transwell小室 | Corning | 354480 |
| Western blot | RIPA裂解液 | NCM Biotech | WB3100 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | NCM Biotech | P002 | |
| 上样缓冲液 | Takara | 9173 | |
| PVDF膜 | Merck millipore | ISEQ00010 | |
| 脱脂牛奶 | BioFroxx | 1172GR100 | |
| CHOP抗体 | Cell Signaling Technology | 2895 | |
| SPP1抗体 | ABclonal | A19092 | |
| β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4967 | |
| HRP标记抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记抗鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| T细胞共培养 | 重组人SPP1 | Gibco | 120-35 |
| 抗CD44抗体 | Creative Biolabs | TAB-128CL | |
| 白细胞介素-2 | Gibco | 200-02 | |
| ELISA | 人SPP1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1347 |
| ROS检测 | 活性氧检测探针 | Invitrogen | C6827 |
| CM-H2DCFDA | Invitrogen | C6827 | |
| 荧光显微镜 | Nikon | d-Eclipse C1 | |
| Seahorse分析 | Seahorse XF Pro代谢分析仪 | Agilent | -- |
| 细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | 103015-100 | |
| 免疫荧光 | SPP1抗体 | Proteintech | 22952-1-AP |
| HMB45抗体 | Abcam | ab787 | |
| CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 | |
| CD44抗体 | Cell Signaling Technology | 37259 | |
| 扫描仪 | ZEISS | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞RNA测序 | 样本来源：9例原发UM，5例患者，其中AT 5例，BM 4例；测序平台：10x Genomics Chromium Next GEM 3' v3.1，Illumina NovaSeq 6000；质控标准：基因数200-7000，UMI 800-30000，线粒体比例<10% 阅读提示：Methods 2.3, 2.4；Results 3.1 |
| 细胞培养 | 细胞系：PIG1, 92.1, MEL202, MEL290, OMM1, OMM2.3, MP46；培养基：RPMI 1640（MP46含20% FBS，其余10% FBS）；添加剂：青霉素-链霉素；培养条件：37°C，5% CO2 阅读提示：Methods 2.9 |
| SPP1过表达与rhSPP1处理 | SPP1过表达方法：未明确说明质粒或转染试剂；rhSPP1浓度：100 ng/mL；检测时间点：48小时收集上清（ELISA） 阅读提示：Methods 2.15；Results 3.6 图6B-E |
| T细胞共培养 | 肿瘤细胞：1×10^6/孔；CD8+ T细胞来源：Milecell Biological Science & Technology Co., Ltd.；比例：1:5；IL-2：10 ng/mL；时间：24小时；检测：Ki-67 FITC, IFN-γ PC7流式 阅读提示：Methods 2.14；Results 3.6 图6F-G |
| Mito-LND处理 | Mito-LND浓度：5 μM；处理时间：24小时（OCR、ROS、Western blot）；CCK-8：0、24、48、72、96小时；Seahorse：15,000细胞/孔，处理24小时 阅读提示：Methods 2.10, 2.16, 2.17；Results 3.6 图6I-K |
| SPP1 ELISA | 细胞接种量：5×10^5/孔（6孔板）；收集时间：48小时；试剂盒：Elabscience E-EL-H1347 阅读提示：Methods 2.15 |