PAM制备与活性成分检测
制备PAM并检测其长期活性成分（H2O2、NO3-、NO2-），以确保实验所用PAM具有稳定的生物学效应。
使用冷等离子体装置处理PBS，以氩气为工作气体，流量300 mL/min，脉冲电压7 kV，处理10分钟；使用紫外分光光度计测定H2O2、NO3-、NO2-浓度。
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等离子体激活培养基通过PPARγ/TGF-β1/SMAD3通路抑制上皮-间质转化并改善肠道纤维化
Plasma-activated media inhibits epithelial-mesenchymal transition and ameliorates intestinal fibrosis through the PPARγ/TGF-β1/SMAD3 pathway.
实验完整度
高包含DSS诱导小鼠肠纤维化模型、TGF-β1诱导IEC-6细胞EMT模型、GW9662抑制剂回复实验及组织病理、分子检测等多层级验证，功能验证和机制验证明确。
主要模型
C57BL/6小鼠DSS诱导肠道纤维化模型 IEC-6大鼠肠隐窝上皮细胞 TGF-β1诱导IEC-6细胞EMT模型 小鼠体内PAM干预模型
重点核对
PAM的制备条件：氩气300 mL/min，脉冲电压7 kV，处理10分钟，距离3 mm，PBS pH 7.0-7.2 DSS诱导模型中，2.5% DSS，5天给药，7天恢复，重复3个循环 PAM腹腔注射剂量：H-PAM为原液，M-PAM为稀释1倍，L-PAM为稀释2倍（100 μL） 5-ASA给药剂量为200 mg/kg，作为阳性对照 体内和体外实验均需检测PPARγ、TGF-β1、SMAD3、EMT标志物及纤维化标志物的表达
摘要
炎症性肠病常并发肠腔狭窄，而肠道纤维化是导致其发展的核心病理过程。目前，尚无有效药物可预防或改善肠道纤维化。既往研究表明，PAM（等离子体激活培养基）通过调节PPARγ/TGF-β1轴抑制上皮-间质转化（EMT）并改善皮肤纤维化。然而，PAM能否改善肠道纤维化尚不清楚。我们使用梯度浓度的PAM干预葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的小鼠肠道纤维化模型，以评估其缓解纤维化的作用并探索具体分子机制。此外，我们使用PAM干预TGF-β1诱导的大鼠肠隐窝上皮细胞（IEC-6）EMT和纤维化体外模型，以进一步探索PAM改善肠道纤维化的分子机制。我们发现PAM通过PPARγ/TGF-β1/SMAD信号通路抑制上皮-间质转化，从而改善肠道纤维化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PAM能否改善肠道纤维化及其分子机制是否与PPARγ/TGF-β1/SMAD3通路调控EMT有关？
- 核心机制
- PAM通过上调PPARγ表达、下调TGF-β1/SMAD3信号通路，抑制EMT过程，从而改善肠道纤维化。
- 主要证据
- 在DSS诱导的小鼠肠纤维化模型中，PAM降低了纤维化标志物COL1A1和α-SMA的表达，增加了PPARγ并降低了TGF-β1和SMAD3水平；在TGF-β1诱导的IEC-6细胞模型中得到一致结果，且GW9662抑制PPARγ部分逆转了PAM的效果。
- 研究意义
- PAM可作为治疗肠道纤维化的新策略，为拓展其在基础医学研究中的应用提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
动物实验：DSS诱导肠纤维化模型及PAM干预
在体内评估PAM对DSS诱导的肠道纤维化的改善作用及安全性。
C57BL/6小鼠随机分为6组，除对照组外，给予2.5% DSS饮水5天，后7天正常饮水，重复3个循环；建模第2天起，治疗组腹腔注射不同浓度PAM（100 μL），阳性对照组灌胃5-ASA（200 mg/kg）；观察体重、DAI评分，结肠长度，血清TNF-α和IL-6水平，结肠组织HE和Masson染色，并检测心肝肺肾等主要脏器毒性。
细胞实验：TGF-β1诱导IEC-6细胞EMT及PAM干预
在体外验证PAM对TGF-β1诱导的IEC-6细胞EMT和纤维化的抑制作用。
IEC-6细胞用不同浓度TGF-β1和PAM处理，CCK8检测细胞活性；用10 ng/mL TGF-β1诱导EMT，同时加入2%、4%、6% PAM处理48小时，检测细胞形态、增殖、迁移，以及EMT和纤维化标志物的表达。
机制验证：PPARγ抑制剂GW9662回复实验
验证PAM的作用是否依赖于PPARγ，从而确认PPARγ/TGF-β1/SMAD3通路在PAM改善肠道纤维化中的作用。
在TGF-β1和6% PAM处理的基础上，加入GW9662（10 μM）共处理48小时，观察细胞形态、增殖、迁移及分子标志物变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞处理与造模 | 转化生长因子-β1 | PeproTech | -- |
| 机制验证 | GW9662 | MCE | 22978-25-2 |
| Western blot | α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP |
| PPARγ抗体 | Proteintech | 16643-1-AP | |
| TGF-β1抗体 | Proteintech | 26155-1-AP | |
| Tubulin抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| SMAD3抗体 | Abcam | ab84177 | |
| 磷酸化SMAD3抗体 | Abcam | ab52903 | |
| GAPDH抗体 | Servicebio | GB11002-100 | |
| β-actin抗体 | ABclonal | ACD26 | |
| 抗兔二抗 | SAB | L3012 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素溶液 | -- | -- | |
| 胰岛素 | -- | -- | |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠 | Yeasen Biotechnology | 60316ES60 |
| 5-氨基水杨酸 | -- | -- | |
| ELISA | TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience Biotechnology | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Epizyme Biotech | PC101 |
| 蛋白酶抑制剂 | Epizyme Biotech | GRF101 | |
| 磷酸酶抑制剂 | Epizyme Biotech | GRF102 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | P0012 | |
| 上样缓冲液 | Epizyme Biotech | LT101S | |
| RT-qPCR | RNA提取试剂盒 | Vazyme Biotech | RC112 |
| cDNA合成试剂盒 | Vazyme Biotech | R223 | |
| 实时荧光定量PCR仪 | ABI | 7500 | |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂 | APExBIO Technology | K1018 |
| 统计分析 | GraphPad Prism | -- | -- |
| PAM制备 | 冷等离子体装置 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PAM制备 | 气体种类（氩气）及流量（300 mL/min）、脉冲电压（7 kV）和处理时间（10分钟）、等离子体源与液面距离（3 mm）、PBS体积（30 mL）和pH（7.0-7.2） 阅读提示：见Methods 2.2 Preparation of PAM |
| DSS诱导小鼠肠纤维化模型 | 小鼠品系（C57BL/6，6-8周龄，雄性）、体重约23g、DSS浓度（2.5%）、给药周期（5天DSS+7天恢复，重复3个循环）、饲养条件（SPF级） 阅读提示：见Methods 2.3 Animal experiments |
| PAM体内给药 | PAM浓度（H-PAM原液、M-PAM稀释1倍、L-PAM稀释2倍）、给药方式（腹腔注射100 μL）、给药开始时间（DSS给药第2天）、5-ASA剂量（200 mg/kg） 阅读提示：见Methods 2.3 Animal experiments |
| 细胞系与培养条件 | IEC-6细胞来源（中乔新舟，货号ZQ0783）、培养基（高糖DMEM+10% FBS+1%青霉素-链霉素+0.01 mg/mL胰岛素）、培养环境（37°C，5% CO2） 阅读提示：见Methods 2.4 Cell culture |
| TGF-β1诱导IEC-6细胞EMT模型 | TGF-β1浓度（10 ng/mL）、PAM浓度（2%、4%、6%）、处理时间（48小时）、细胞接种密度（6孔板2×10^5/孔）、无血清饥饿时间（24小时） 阅读提示：见Methods 2.5 Cell treatment |
| GW9662抑制剂实验 | GW9662浓度（10 μM）、处理时间（48小时）、PAM浓度（6%）、TGF-β1浓度（10 ng/mL） 阅读提示：见Methods 2.5 Cell treatment和2.10 Cell proliferation assay |
| 分子检测 | Western blot：组织量（50 mg）、细胞处理时间（48小时）、裂解液比例（RIPA:蛋白酶抑制剂:磷酸酶抑制剂=100:1:1）、离心条件（8000 g 10分钟）、蛋白定量；RT-qPCR：组织量（30 mg）、引物序列（见补充表S2和S3） 阅读提示：见Methods 2.8 Western blot和2.9 Real-time quantitative PCR |