肿瘤条件培养基制备与蛋白质组学分析
鉴定结直肠癌细胞分泌的差异蛋白，特别是TFF3。
收集DLD1和NCM460细胞的条件培养基，进行蛋白质组学分析，鉴定CM和TCM中的差异表达蛋白，并通过ELISA验证TFF3在癌细胞系上清中的高分泌。
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抑制TFF3通过下调结直肠癌中PD-L1的表达改善CD8+ T细胞的浸润和功能
Inhibition of TFF3 improves the infiltration and function of CD8+ T cells by downregulating the expression of PD-L1 in colorectal cancer.
实验完整度
高包含体外细胞培养与qPCR、体内CT-26移植瘤模型、流式分析、RNA-seq、Western blot及Co-IP等多层级验证，并明确功能与机制验证。
主要模型
DLD1结直肠癌细胞系 CT-26小鼠结直肠癌细胞系 CD8+ T细胞 BALB/c小鼠皮下移植瘤模型
重点核对
TFF3敲低细胞系的构建及敲低效率验证（shRNA） 体内实验中CT-26细胞皮下注射剂量：1×10^6个细胞/100 μL PBS 肿瘤体积测量时间点：第6天起每3天测量一次 CD8+ T细胞与TCM共培养时间：48小时 CAR-T细胞与DLD1共培养效靶比：1:2，共培养20小时
摘要
背景：结直肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，死亡率高。TFF3是一种在多种癌症中表达的分泌蛋白。本研究旨在报道抑制TFF3可增加结直肠肿瘤组织中CD8+ T细胞的功能和浸润。方法：蛋白质组学分析证实了结直肠癌细胞上清液中分泌型TFF3的高表达，并利用数据库分析了肿瘤组织中的免疫浸润。采用qPCR实验证明分泌型TFF3的高水平影响CD8+ T细胞的功能。采用体内实验观察TFF3敲低对肿瘤生长和免疫细胞浸润的影响。分选肿瘤浸润T淋巴细胞进行RNA测序并解释机制。结果：抑制肿瘤组织中TFF3的表达可改善免疫细胞浸润并增强抗肿瘤作用。TFF3敲低通过AKT/mTOR通路下调肿瘤组织中PD-L1的表达，从而增强CD8+ T细胞的功能。结论：TFF3敲低改善了CD8+ T细胞的浸润和抗肿瘤能力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TFF3是否与结直肠癌中的免疫浸润相关，以及其作用机制是什么？
- 核心机制
- TFF3敲低通过抑制AKT/mTOR通路下调肿瘤组织中PD-L1的表达，从而增强CD8+ T细胞的功能和浸润。
- 主要证据
- 体外实验显示TFF3敲低后CD8+ T细胞中GZMB、TNF和IFNG表达升高；体内CT-26移植瘤模型显示TFF3敲低后肿瘤生长受抑、CD8+ T细胞浸润增加，血清TNF和GZMB升高；RNA-seq和Western blot验证了PD-L1表达下降及AKT/mTOR通路抑制。
- 研究意义
- TFF3作为结直肠癌免疫治疗的潜在靶点，其抑制可能增强CD8+ T细胞浸润和抗肿瘤免疫，并与免疫检查点抑制剂或CAR-T细胞疗法协同作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TFF3表达与免疫浸润的关联分析
通过TCGA数据库分析TFF3表达与肿瘤组织中免疫细胞浸润的关系。
利用TCGA-COAD数据库，按TFF3表达中位数将患者分为高、低表达组，使用CIBERSORT分析免疫细胞浸润差异，并比较GZMB和PRF1表达。
体外验证TFF3对CD8+ T细胞功能的影响
验证TFF3敲低是否影响CD8+ T细胞的杀伤功能。
构建DLD1 TFF3敲低细胞系，收集TCM与CD8+ T细胞共培养，通过qPCR检测GZMB、TNF、IFNG等表达。
体内验证TFF3敲低对肿瘤生长和免疫浸润的影响
观察TFF3敲低对BALB/c小鼠皮下肿瘤生长及免疫细胞浸润的影响。
将CT-26 shNC和shTFF3细胞皮下接种于BALB/c小鼠，测量肿瘤体积，流式分析肿瘤浸润免疫细胞，ELISA检测血清和肿瘤间质液中细胞因子，免疫荧光检测CD8+ T细胞浸润。
RNA测序分析肿瘤浸润T细胞转录组
揭示TFF3敲低后肿瘤浸润T淋巴细胞中基因表达变化和通路富集。
分选肿瘤浸润T淋巴细胞（CD45+CD3+）进行RNA-seq，分析差异表达基因和KEGG富集通路。
机制验证：TFF3敲低对PD-L1表达及AKT/mTOR通路的影响
验证TFF3敲低下调PD-L1表达是否通过AKT/mTOR通路，并检测TFF3与AKT的相互作用。
Western blot检测肿瘤组织中PD-L1、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的表达，Co-IP验证TFF3与AKT的相互作用。
功能验证：CAR-T细胞对TFF3敲低肿瘤细胞的杀伤作用
验证TFF3敲低是否增强CAR-T细胞的抗肿瘤细胞毒性。
构建CEA-CAR-T细胞，与DLD1 shNC和shTFF3细胞以1:2效靶比共培养20小时，流式检测凋亡率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Thermo Fisher | -- |
| 淋巴细胞分离液 | -- | -- | |
| T细胞培养 | 重组人白细胞介素-2 | STEMCELL | -- |
| CD3/CD28 | STEMCELL | -- | |
| T细胞分选 | 人T细胞分离试剂盒 | BioLegend | -- |
| ELISA | 人TFF3 ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| 小鼠TNF和GZMB ELISA试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 流式分析 | 抗CD3-APC抗体 | BioLegend | 100236 |
| 抗CD4-PE抗体 | BioLegend | 100408 | |
| 抗CD8-BV421抗体 | BioLegend | 100753 | |
| 抗CD49b-PE/Cy7抗体 | BioLegend | 103518 | |
| 抗CD11c-BV605抗体 | BioLegend | 117334 | |
| 抗CD19-APC/Cy7抗体 | BioLegend | 115530 | |
| 抗CD45-BV711抗体 | BioLegend | 103147 | |
| 抗CD11b-BV785抗体 | BioLegend | 101243 | |
| 免疫荧光 | 兔抗小鼠CD8抗体 | Abcam | 217344 |
| 山羊抗兔Alex Fluor 647抗体 | Thermo Fisher | A-21244 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Thermo Fisher | -- | |
| RNA测序 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Illumina测序平台 | Illumina | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | -- | -- | |
| PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 60475 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT抗体 | Abcam | 179463 | |
| 磷酸化mTOR抗体 | Abcam | 109268 | |
| mTOR抗体 | Abcam | 134903 | |
| 二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 轻链特异性二抗 | Cell Signaling Technology | 5127 | |
| 免疫沉淀 | Pierce交联磁性免疫沉淀/共免疫沉淀试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| TFF3抗体 | Abcam | 108599 | |
| IgG抗体 | Cell Signaling Technology | 3900 | |
| CAR-T构建 | GV401慢病毒载体 | Genechem | -- |
| 慢病毒包装 | pHelper 1.0载体 | Addgene | -- |
| pHelper 2.0载体 | Addgene | -- | |
| 凋亡检测 | Annexin-V和PI凋亡检测试剂盒 | BioLegend | 640932 |
| 单细胞悬液制备 | 胶原酶/透明质酸酶溶液 | STEMCELL | -- |
| DNase I溶液 | STEMCELL | -- | |
| 红细胞裂解液 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞分选 | 小鼠CD45分选试剂盒 | STEMCELL | -- |
| CD3分选试剂盒 | BioLegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TCM制备 | 细胞培养条件（RPMI 1640培养基，无血清培养48小时）；T细胞与TCM共培养比例（3:1） 阅读提示：材料与方法：Tumor-conditioned medium (TCM) and conditional medium (CM) preparation |
| 蛋白质组学分析 | 细胞系（DLD1和NCM460）；差异蛋白筛选阈值（p-value < 0.05, |log2FC| > 1） 阅读提示：材料与方法：Proteomics and TCGA datasets analysis |
| 原代T细胞培养 | PBMC来源（健康供者外周血）；CD8+ T细胞分选试剂盒；刺激因子（10 ng/mL rhIL-2，CD3/CD28） 阅读提示：材料与方法：The culture of primary T cells |
| 体外共培养 | TCM与CD8+ T细胞共培养时间（48小时）；qPCR检测基因（GZMB, TNF, IFNG） 阅读提示：结果图2F及其图注；材料与方法：qPCR analysis |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系、性别、年龄（健康雄性BALB/c，6-8周龄）；CT-26细胞注射剂量（1×10^6个/100 μL PBS）；肿瘤体积测量时间点（第6天起每3天一次）；结束时间（第24天） 阅读提示：材料与方法：In vivo antitumor studies |
| 肿瘤浸润免疫细胞检测 | 抗体组合（CD3, CD4, CD8, CD49b, CD11c, CD19, CD45, CD11b, 7AAD）；染色时间（30分钟）；样本数（n=5） 阅读提示：材料与方法：Flow cytometry of tumor-infiltrating immune cells；图3E图注 |
| RNA测序 | 分选标记（CD45+CD3+）；参考基因组（GRCm39）；差异基因阈值（p-value < 0.05, |log2FC| > 1） 阅读提示：材料与方法：RNA sequencing |
| Western blot | 抗体列表（PD-L1, p-AKT, AKT, p-mTOR, mTOR）；蛋白提取条件（RIPA缓冲液含抑制剂）；样本数（n=3） 阅读提示：材料与方法：Western blot；图5B、图6A-B图注 |
| Co-IP | 抗体（TFF3, IgG）；使用试剂盒（Pierce Crosslink Magnetic IP/Co-IP Kit）；细胞系（HT-29） 阅读提示：材料与方法：Immunoprecipitation |
| CAR-T细胞杀伤实验 | 构建CAR结构（CEA）；效靶比（1:2）；共培养时间（20小时）；凋亡检测试剂盒（Annexin-V/PI） 阅读提示：材料与方法：Flow cytometry of co-culture apoptosis；图6E图注 |
| 统计分析 | 两组比较（t检验或非参数秩和检验）；多组比较（ANOVA或Kruskal-Wallis H检验）；显著性水平（* < 0.05） 阅读提示：材料与方法：Statistical analysis |