临床样本收集与分群
比较HCC患者与健康对照的肠道菌群和代谢物差异，并分析免疫治疗反应者与非反应者的差异。
收集29例HCC患者和29例健康对照的粪便样本，另收集6例免疫治疗反应者和6例非反应者的粪便样本，用于16S rDNA和代谢组学分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
双歧杆菌通过JAK通路增强抗PD-1在肝细胞癌中的疗效
Bifidobacterium boosts anti-PD-1 effectiveness through JAK pathway in hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含临床样本16S rDNA和代谢组学分析、动物模型（FMT、双歧杆菌/异丁酸联合αPD-1）以及体外细胞实验（CD8+T细胞共培养、JAK1过表达）等多层级验证。
主要模型
HCC患者粪便样本 C57BL/6J小鼠肝癌模型 Hepa1-6细胞系 小鼠CD8+T细胞
重点核对
粪便样本分组：HCC组 vs HC组，各29例 免疫治疗反应者（R）与非反应者（NR）各6例 AVMN抗生素混合物处理（含氨苄青霉素、新霉素、甲硝唑、万古霉素） αPD-1给药剂量200μg/只，每3天一次 异丁酸（S.I）浓度150mM饮用水
摘要
肝细胞癌（HCC）是一种常见且致命的癌症。肠道菌群影响肿瘤免疫和免疫治疗疗效，但确切机制尚不清楚。一项研究使用16S rDNA分析和代谢组学比较了HCC患者和健康对照（HC）的肠道菌群。研究发现HC组双歧杆菌水平较高，且双歧杆菌与异丁酸呈正相关。动物模型显示，HC粪便与αPD-1联合治疗比HCC粪便与αPD-1联合治疗更有效地减小肿瘤体积。双歧杆菌或异丁酸盐与αPD-1联合治疗也减小了肿瘤大小。体外实验中，异丁酸盐刺激的CD8+T细胞增加了IFN-γ分泌，抑制了肝癌细胞，并下调了JAK/STAT3通路。联合治疗增加了肿瘤微环境中CD8+T细胞和IFN-γ水平，并减少了JAK/STAT3信号。这表明双歧杆菌和异丁酸盐可以抑制肿瘤生长，为肠道菌群-宿主相互作用以及克服HCC免疫治疗耐药性提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道菌群及其代谢物如何通过CD8+T细胞和JAK/STAT3通路影响HCC免疫治疗（抗PD-1）的疗效？
- 核心机制
- 双歧杆菌在肠道中水解发酵多糖产生异丁酸，激活CD8+T细胞分泌IFN-γ，进而抑制肿瘤细胞JAK/STAT3信号通路，促进肿瘤细胞凋亡，增强免疫治疗疗效。
- 主要证据
- 临床样本显示双歧杆菌与异丁酸水平正相关，且R组高于NR组；动物模型中双歧杆菌或异丁酸联合αPD-1显著减小肿瘤体积并增加IFN-γ+CD8+T细胞；体外实验证实异丁酸刺激CD8+T细胞分泌IFN-γ，抑制Hepa1-6细胞增殖，并下调JAK/STAT3通路。
- 研究意义
- 研究为干预HCC免疫治疗耐药提供了理论基础，提示评估肠道双歧杆菌丰度或异丁酸水平可能作为预测免疫治疗反应的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
16S rDNA测序与代谢组学分析
鉴定HCC与健康对照、免疫治疗反应者与非反应者之间的差异菌群和差异代谢物。
提取粪便细菌DNA进行16S rDNA测序，基于OTU分析α多样性和β多样性；通过LC-MS/MS进行代谢组学分析，鉴定差异代谢物双歧杆菌与异丁酸正相关。
动物模型建立与处理
验证肠道菌群（HC vs HCC粪便）和代谢物（异丁酸）对αPD-1疗效的影响。
使用C57BL/6J小鼠建立肝癌移植瘤模型，用AVMN清除肠道菌群，分别进行FMT、双歧杆菌灌胃、异丁酸饮水、αPD-1注射及联合处理，测量肿瘤体积。
肿瘤组织病理与免疫组化分析
评估肿瘤细胞增殖、凋亡和JAK/STAT3通路蛋白表达的变化。
对肿瘤组织进行H&E染色、Ki67、Cyclin D1、PARP及JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3的免疫组化染色，评分比较不同处理组。
体外CD8+T细胞与肝癌细胞共培养
验证异丁酸（S.I）对CD8+T细胞活化及肝癌细胞增殖和JAK/STAT3通路的影响。
从小鼠脾脏分离CD8+T细胞，用不同浓度S.I处理，与Hepa1-6细胞共培养，检测IFN-γ分泌、细胞活力及Western blot分析JAK/STAT3通路蛋白。
临床相关性验证
验证双歧杆菌和异丁酸水平与HCC患者免疫治疗反应的相关性。
对R和NR患者粪便样本进行16S rDNA测序和代谢组学分析，比较双歧杆菌丰度和异丁酸水平，并进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 新霉素 | Aladdin | -- |
| 甲硝唑 | Aladdin | -- | |
| 万古霉素 | Aladdin | -- | |
| 异丁酸钠 | Macklin | -- | |
| 抗PD-1抗体 | BioXcell | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | -- | |
| 细胞分离 | Lympholyte-M细胞分离液 | Cedarlane | -- |
| CD8+T细胞分选磁珠 | Miltenyi | -- | |
| 细胞培养 | 白细胞介素-2 | MCE | -- |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Elabscience | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Beyotime | -- | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| QuickBlock封闭液 | Beyotime | -- | |
| TBST缓冲液 | Sango Biotech | -- | |
| JAK1抗体 | CST | 3332 | |
| pY1034/1035-JAK1抗体 | CST | 3331 | |
| STAT3抗体 | CST | 9139 | |
| pTyr705-STAT3抗体 | CST | 9131 | |
| HRP标记二抗 | Beyotime | -- | |
| ECL检测试剂 | Beyotime | -- | |
| 免疫组化 | JAK1抗体 | CST | 3344 |
| pY1034/1035-JAK1抗体 | Thermo | PA5-104554 | |
| STAT3抗体 | Pormad | 30122 | |
| pTyr705-STAT3抗体 | Zen-bioscience | 381552 | |
| PARP抗体 | Abways | CY6850 | |
| Cyclin D1抗体 | Beyotime | AF1183 | |
| DAB显色液 | Beyotime | -- | |
| 免疫荧光 | CD8抗体 | Servicebio | GB15068 |
| IFN-γ抗体 | Cohesion Biosciences | CPA1575 | |
| DAPI工作液 | Servicebio | -- | |
| Opal染料 | PerkinElmer | -- | |
| 16S rDNA分析 | Illumina Nextseq测序平台 | Illumina | -- |
| 代谢组学分析 | UHPLC-Q Exactive HF-X系统 | Thermo | -- |
| 动物实验 | C57BL/6J小鼠 | Slack Co., LTD. | -- |
| 细胞实验 | Hepa1-6细胞 | Chinese Academy of Sciences | -- |
| 伪青春双歧杆菌 | Chinese Academy of Medical Sciences | -- | |
| 长双歧杆菌 | Chinese Academy of Medical Sciences | -- | |
| 动物实验 | TS肉汤 | Hope Bio-Technology Co., LTD. | -- |
| PYG培养基 | Hope Bio-Technology Co., LTD. | -- | |
| 双歧杆菌培养基 | Haibo Biotechnology Co., LTD. | -- | |
| 厌氧袋 | Biotechnology Co., LTD. | -- | |
| 细胞实验 | 磷酸盐缓冲液 | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | 柠檬酸抗原修复液 | Servicebio | -- |
| 过氧化氢 | Agilent Technologies | -- | |
| TBST缓冲液 | Servicebio | -- | |
| HRP标记IgG | Servicebio | -- | |
| H&E染色 | 伊红 | 不是明确提供 | -- |
| 分化液 | Beyotime | -- | |
| 中性芝麻油 | 文中未明确说明 | -- | |
| 自动染色机 | Leica | -- | |
| 扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 免疫荧光 | 全自动染色机 | Leica | LEICAST5020 |
| 微波炉 | Galanz | -- | |
| 扫描仪 | 3DHISTECH | -- | |
| 免疫组化 | 干燥箱 | Yiheng Scientific Instruments Co., Ltd. | -- |
| 抗原修复仪 | 文中未明确说明 | -- | |
| 自动免疫组化仪 | DAKO | -- | |
| 细胞增殖检测 | 酶标仪 | Sunrise Ltd. | -- |
| ELISA | 酶标仪 | Thermo | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | HCC组和HC组各29例；排除标准（近2周用药、个人习惯等）；R组和NR组各6例；免疫治疗反应评估标准（RECIST） 阅读提示：Methods: Sample collection |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别；AVMN抗生素混合物组成和给药时间；Hepa1-6细胞接种数量和体积；FMT、双歧杆菌、异丁酸、αPD-1给药方案和时间 阅读提示：Methods: Animal experiment; Fig. 4a |
| 体外细胞实验 | CD8+T细胞分离方法；S.I浓度和处理时间；共培养比例和时间；JAK1过表达质粒转染方法 阅读提示：Methods: Cell experiment; Fig. 5 legend |
| JAK/STAT3通路检测 | Western blot一抗稀释比例；免疫组化一抗稀释比例和评分标准；免疫荧光抗体和染色步骤 阅读提示：Methods: Western blot, Immunohistochemistry, Immunofluorescence |
| 临床相关性分析 | 16S rDNA测序和代谢组学分析方法；α多样性和β多样性指标；双歧杆菌和异丁酸定量方法；相关性分析（Pearson） 阅读提示：Methods: 16S rDNA analysis, Metabolomics analysis; Fig. 7 legend |