耐药细胞系建立
生成对vemurafenib耐药的黑色素瘤细胞系以模拟临床BRAFi耐药。
将451Lu和UACC62细胞持续暴露于递增浓度的vemurafenib（0.2, 0.5, 1, 2, 5 μM），16周后获得耐药亚系451Lu-R和UACC62-R。
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利用线粒体功能障碍克服晚期黑色素瘤中的BRAF抑制剂耐药：双硫仑作为铜离子载体的作用
Exploiting mitochondrial dysfunction to overcome BRAF inhibitor resistance in advanced melanoma: the role of disulfiram as a copper ionophore.
实验完整度
高包含体外耐药细胞模型、体内裸鼠移植瘤模型、多种细胞功能实验（CCK-8、克隆形成）、线粒体结构功能检测（TEM、JC-1、Seahorse）、RNA-seq、CRISPR-Cas9敲除及蛋白质组学等独立证据，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
451Lu和UACC62人黑色素瘤细胞系（BRAF V600E突变）及其vemurafenib耐药亚系451Lu-R和UACC62-R BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型
重点核对
耐药细胞系建立：vemurafenib浓度递增诱导16周（0.2, 0.5, 1, 2, 5 μM） 处理条件：DSF 1.5 μM，vemurafenib 5 μM，trametinib 2 nM 铜螯合剂TTM预处理浓度20 μM TXNIP敲除：CRISPR-Cas9靶向序列TCTCTTGAGTTGGCTGGCTC，puromycin筛选浓度10 μg/mL 动物实验：6周龄雌性BALB/c裸鼠，皮下注射1×10^7细胞，肿瘤体积达50 mm^3后分组给药（vemurafenib 30 mg/kg，DSF 60 mg/kg，TTM 0.3 mg/kg）
摘要
对靶向治疗的耐药是晚期BRAF突变黑色素瘤的一大挑战。即使采用BRAF+MEK抑制剂联合治疗，约70%的患者仍在两年内出现疾病进展，凸显了超越MAPK信号通路抑制的新策略的必要性。本研究探讨铜离子载体双硫仑（DSF）诱导的线粒体功能障碍是否能有效对抗BRAF抑制剂耐药。我们使用BRAF突变的451Lu和UACC62细胞建立了两种BRAF抑制剂（BRAFi）耐药黑色素瘤细胞系。体内实验使用裸鼠皮下植入进行。通过细胞活力和集落形成实验评估治疗效果，通过透射电子显微镜评估线粒体形态。使用Seahorse代谢分析仪测量线粒体呼吸，通过流式细胞术和共聚焦显微镜评估氧化应激。RNA测序鉴定了受细胞内铜水平调控的下游因子，并使用CRISPR-Cas9系统在BRAFi耐药细胞中敲除候选基因以进行机制验证。我们提供了证据表明，DSF以铜依赖性方式诱导BRAFi耐药黑色素瘤细胞死亡，通过增加氧化应激严重损害线粒体结构和功能。RNA-seq和免疫印迹显示，硫氧还蛋白相互作用蛋白（TXNIP）的表达响应DSF显著增加。TXNIP敲除通过减轻氧化应激降低了DSF诱导的细胞毒性。这些发现在体内实验中得到了支持。此外，我们证明了TXNIP介导的氧化损伤涉及其与硫氧还蛋白2（TRX2）的相互作用。总之，使用双硫仑靶向线粒体功能可有效抑制BRAFi耐药黑色素瘤细胞，且独立于MAPK信号阻断。这些结果指出，双硫仑与BRAF抑制剂联合使用可能是克服BRAFi耐药的潜在策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DSF能否通过诱导线粒体功能障碍来克服BRAF抑制剂耐药，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- DSF作为铜离子载体增加细胞内铜积累，导致线粒体氧化应激，TXNIP表达上调并转位至线粒体，通过与TRX2相互作用抑制其抗氧化功能，引发线粒体结构损伤和功能抑制，从而诱导细胞死亡。
- 主要证据
- 体外和体内实验显示DSF+Vem协同抑制耐药细胞生长，铜螯合剂TTM可逆转；TEM显示线粒体肿胀和嵴异常；JC-1检测显示MMP下降；Seahorse显示OCR降低；ROS水平升高；TXNIP敲除或TXNIP-IN-1处理可减轻线粒体损伤和细胞死亡。
- 研究意义
- 研究表明靶向线粒体功能的DSF与BRAF抑制剂联合可能是克服BRAFi耐药的有前景策略，为药物重定位提供证据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外药效验证
评估DSF单独或与vemurafenib联合对耐药细胞的抑制作用及铜依赖性。
使用CCK-8和集落形成实验检测细胞活力；使用铜螯合剂TTM及凋亡、坏死性凋亡、铁死亡、自噬抑制剂预处理，观察对细胞死亡的影响。
体内药效验证
在裸鼠移植瘤模型中验证DSF与vemurafenib联合的抑制效果及铜依赖性。
将耐药细胞皮下接种裸鼠，成瘤后随机分组给予Vem、DSF、Vem+DSF或Vem+DSF+TTM治疗，测量肿瘤体积和重量。
线粒体功能与结构分析
探究DSF+Vem对线粒体结构和功能的影响。
利用RNA-seq分析差异表达基因；TEM观察线粒体形态；JC-1染色检测MMP；ATP检测；Seahorse测定OCR和ECAR。
氧化应激机制验证
验证DSF诱导的线粒体功能障碍是否依赖于氧化应激，以及铜的作用。
使用MitoSOX检测mt-ROS；使用Mito-TEMPO清除mt-ROS，观察对细胞活力、线粒体形态和功能的影响；使用TTM剥夺铜，检测ROS、MMP、OCR等。
关键分子TXNIP的鉴定与功能验证
确定TXNIP是否介导DSF诱导的线粒体功能障碍。
通过RNA-seq筛选TXNIP，WB验证表达；使用CRISPR-Cas9敲除TXNIP，检测细胞活力、线粒体结构、MMP、ATP、OCR、mt-ROS；体内实验验证。
机制深化：TXNIP-TRX2相互作用
阐明TXNIP与TRX2相互作用在氧化损伤中的作用。
使用STRING数据库和DIA蛋白质组学预测相互作用；使用TXNIP-IN-1抑制TXNIP-TRX复合物形成，检测细胞活力和线粒体功能；敲低TRX1或TRX2观察对细胞死亡的影响；Co-IP验证TXNIP与TRX1/TRX2的相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证线粒体功能
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Corning | -- |
| 胎牛血清 | Corning | 10-040-CV | |
| 药物治疗 | 威罗菲尼 | MedChemExpress | HY-12057 |
| 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 | |
| 双硫仑 | Selleck | NSC 190940 | |
| 四硫代钼酸铵 | Sigma-Aldrich | 323446 | |
| 细胞功能检测 | Z-VAD-FMK | MedChemExpress | HY-16658B |
| Boc-D-FMK | ENZO | ALX-260-071-M005 | |
| 坏死性凋亡抑制剂-1 | MedChemExpress | HY-15760 | |
| 铁死亡抑制剂-1 | MedChemExpress | HY-100579 | |
| 氯喹 | MedChemExpress | HY-17589A | |
| 氧化应激检测 | Mito-TEMPO | MedChemExpress | HY-112879 |
| MitoSOX™ Red | Invitrogen | M36008 | |
| 线粒体功能检测 | JC-1线粒体膜电位染料 | Invitrogen | 65-0851-38 |
| 能量代谢检测 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0026 |
| 细胞培养 | Hanks平衡盐溶液 | Merck Millipore | H8264 |
| 蛋白检测 | BCA蛋白检测试剂盒 | ElabScience | E-BC-K318-M |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL蛋白检测系统 | Thermo Scientific | -- | |
| Caspase 3抗体 | Proteintech | 19677-1-AP | |
| TXNIP抗体 | Abcam | ab188865 | |
| 硫氧还蛋白2抗体 | Cell Signaling Technology | 14907 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 硫氧还蛋白抗体 | Proteintech | 14999-1-AP | |
| TOM20抗体 | Proteintech | 11802-1-AP | |
| ATP7A抗体 | Abcam | ab308524 | |
| ATP7B抗体 | Abcam | ab124973 | |
| SLC31A1抗体 | Proteintech | 67221-1-IG | |
| DLAT抗体 | Proteintech | 13426-1-AP | |
| LIAS抗体 | Proteintech | 11577-1-AP | |
| FDX1抗体 | Proteintech | 12592-1-AP | |
| 微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| 山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00004-1 | |
| 山羊抗兔IgG | Proteintech | SA00001-2 | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | GK10001 | GK10001 |
| Model 680酶标仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 氧化应激检测 | 二氢乙锭 | Sigma-Aldrich | D7008 |
| 免疫共沉淀 | Protein A/G PLUS-琼脂糖 | Santa Cruz | sc-2003 |
| TXNIP(D5F3E)抗体 | Cell Signaling Technology | 14715 | |
| 对照IgG | Proteintech | 30000-0-AP | |
| 线粒体标记 | MitoTracker™ Red CMXROS | Life technologies | M7512 |
| 免疫荧光 | 山羊抗兔IgG H&L（FITC） | Zhuangzhibio | EK023 |
| 山羊抗小鼠IgG H&L（Cy3） | Zhuangzhibio | EK012 | |
| 透射电镜 | JEM-1400FLASH透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa™流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 共聚焦显微镜 | Zeiss LSM880共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂盒 | Invitrogen | L3000-015 |
| 基因敲除 | 慢病毒（CRISPR-Cas9） | Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 嘌呤霉素 | Beyotime | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| siRNA转染 | 靶向FDX1的siRNA | Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 靶向TRX1的siRNA | Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 靶向TRX2的siRNA | Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 质粒转染 | FDX1质粒 | Beijing Tsingke Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 细胞免疫荧光 | 山羊血清 | Gibco | -- |
| Triton X-100 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞系建立 | vemurafenib浓度梯度（0.2, 0.5, 1, 2, 5 μM）和时间（16周），细胞初始接种密度（5×10^3细胞/96孔） 阅读提示：见Methods部分'Establishment of BRAFi-resistant cells' |
| 体外药物处理 | DSF浓度（1.5 μM），vemurafenib浓度（5 μM），处理时间（48小时，CCK-8） 阅读提示：见Methods部分'Materials'和'Cell viability assay'，图1A图注 |
| 细胞死亡机制 | TTM浓度（20 μM），Z-VAD-FMK（30 μM），Boc-D-FMK（50 μM），Necrostatin-1（20 μM），Ferrostatin-1（10 μM），Chloroquine（5 μM） 阅读提示：见图1E-I图注 |
| 线粒体功能检测 | JC-1孵育时间（30分钟，37°C），MitoSOX浓度（流式5 μM，共聚焦25 μM），Seahorse药物浓度（Oligomycin 1 μM，FCCP 1 μM，Rotenone/Antimycin A 2 μM；葡萄糖100 mM，Oligomycin 10 μM，2-DG 500 μM） 阅读提示：见Methods部分'Mitochondrial membrane potential (MMP)'、'Mitochondrial reactive oxygen species (mt-ROS) assays'、'Seahorse assays' |
| 氧化应激干预 | Mito-TEMPO浓度（文中未明确说明），TTM浓度（20 μM） 阅读提示：见图3C和图4A图注 |
| TXNIP敲除实验 | CRISPR-Cas9靶向序列（TCTCTTGAGTTGGCTGGCTC），筛选浓度（puromycin 10 μg/mL），验证方法（WB） 阅读提示：见Methods部分'CRISPR-Cas9'和图5图注 |
| 体内实验 | 动物品系（BALB/c nude mice），周龄（6周），性别（雌性），接种细胞量（1×10^7），给药剂量（vemurafenib 30 mg/kg，DSF 60 mg/kg，TTM 0.3 mg/kg），起始肿瘤体积（50 mm^3），治疗周期（14天） 阅读提示：见Methods部分'Animal experiments'和图5J-L图注 |
| TXNIP-TRX2机制验证 | TXNIP-IN-1浓度（文中未明确说明），siRNA序列（si-TRX1，si-TRX2），Co-IP抗体（TXNIP(D5F3E)） 阅读提示：见Methods部分'Materials'、'siRNA transfection and plasmid vectors'、'Co-immunoprecipitation (Co-IP)'和图6图注 |