转录组筛选关键基因
筛选参与季节性换毛的潜在关键基因
对欧亚红松鼠夏季和冬季换毛期皮肤组织进行RNA-Seq，分析差异表达基因，发现Rorα在换毛期显著下调。
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视黄酸相关孤儿受体α可能高度参与季节性换毛的调控
The Retinoic-Acid-Related Orphan Receptor Alpha May Be Highly Involved in the Regulation of Seasonal Hair Molting.
实验完整度
高包含动物转录组测序和细胞功能实验，并通过CUT&RUN、EMSA验证RORA与靶基因启动子直接结合，功能与机制验证完整。
主要模型
欧亚红松鼠皮肤组织 大鼠原代毛囊干细胞
重点核对
欧亚红松鼠皮肤组织样本：3只1岁龄雄性，6月和10月采集 HFSCs药物处理：褪黑素浓度1000 ng/L，SR1078和SR3335浓度10 μM，处理24 h RORA激活对细胞周期的影响：G0/G1期比例升高 RORA与Ccna2和Ccne1启动子结合：CUT&RUN和EMSA验证
摘要
哺乳动物的季节性换毛是一种关键的生存策略，然而其潜在的分子机制尚未完全阐明。褪黑素作为光周期信号传递的桥梁，在动物的季节性换毛中发挥重要的调控作用，且褪黑素信号的生理调节效应高度依赖于视黄酸相关孤儿受体α（Rorα）。毛囊干细胞（HFSCs）是毛囊再生和季节性更替过程中最重要的细胞类型。因此，本研究旨在探讨褪黑素及其核受体RORA对HFSCs的调控作用。本研究发现RORA通过抑制HFSCs的细胞周期来下调细胞增殖水平，同时促进HFSCs凋亡并影响参与铁死亡的一些基因的表达。RORA可直接结合细胞周期蛋白基因Ccna2和Ccne1的启动子区域以调节其转录。褪黑素可能通过下调RORA水平来增强HFSCs的活力。本研究表征了褪黑素及其核受体RORA对HFSCs活力的影响以及部分潜在的分子机制。这些发现为动物毛囊发育调控的研究提供了理论基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 褪黑素及其核受体RORA如何调控毛囊干细胞的活力，从而参与动物季节性换毛？
- 核心机制
- RORA通过直接结合Ccna2和Ccne1等细胞周期蛋白基因的启动子区域，抑制其转录，导致细胞周期阻滞于G0/G1期，从而抑制HFSCs增殖；同时促进HFSCs凋亡。
- 主要证据
- RNA-Seq发现Rorα在换毛期显著下调；CCK-8和Edu实验证明RORA激活抑制HFSC活力和增殖；流式细胞术显示细胞周期阻滞；TUNEL和qPCR证明促进凋亡；CUT&RUN和EMSA证明RORA与Ccna2和Ccne1启动子直接结合。
- 研究意义
- 为动物毛囊发育和季节性换毛研究提供理论基础，Rorα基因可能成为研究褪黑素生理调节作用及动物毛皮产业应用的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力与增殖检测
验证RORA激活对HFSCs活力和增殖的影响
用褪黑素、SR1078和SR3335处理大鼠原代HFSCs，CCK-8检测细胞活力，Edu染色检测增殖。
细胞周期分析
探究RORA激活对细胞周期的影响
流式细胞术分析细胞周期分布，qPCR检测细胞周期蛋白和CDK基因表达，WB检测CDK6蛋白水平。
凋亡检测
探究RORA激活对HFSCs凋亡的影响
TUNEL染色检测凋亡水平，qPCR和WB检测Bcl2和Bax表达。
铁死亡相关检测
探究RORA激活对HFSCs铁死亡的影响
RNA-Seq分析差异表达基因，检测亚铁离子、谷胱甘肽、LPO、MDA水平，qPCR和WB检测铁死亡相关基因表达，并使用Ferrostatin-1进行救援实验。
RORA与靶基因结合验证
验证RORA是否直接结合Ccna2和Ccne1启动子
CUT&RUN结合ddPCR检测启动子片段，EMSA验证直接结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256701 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 表皮生长因子 | MCE | HY-P7092 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | MCE | HY-P5321 | |
| 药物处理 | 褪黑素 | -- | -- |
| SR1078 | -- | -- | |
| SR3335 | -- | -- | |
| RNA-Seq文库构建 | NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7530 |
| RNA提取 | GeneJET RNA提取试剂盒 | Thermo Fisher | K0732 |
| cDNA合成 | PrimeScript RT试剂盒（带gDNA Eraser） | Takara | RR047A |
| qPCR | SsoAdvanced Universal SYBR Green预混液 | Bio-Rad | 1725270 |
| CFX384实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Solarbio | PC0020 |
| 蛋白电泳 | 4×蛋白上样缓冲液 | Takara | 9173 |
| Western blot | SDS-PAGE凝胶 | Genscript | M00653; |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL化学发光液 | -- | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0037 |
| Multiskan FC酶标仪 | Thermo Fisher | 51119180ET | |
| 细胞增殖检测 | EdU工作液 | Beyotime | C0071S |
| 流式细胞术 | Agilent NovoCyte流式细胞仪 | Agilent | -- |
| FxCycle PI/RNase试剂盒 | Invitrogen | F10797 | |
| TUNEL | FITC TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1501 |
| 铁死亡指标检测 | 亚铁离子检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K881-M |
| 总谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K097-M | |
| 丙二醛检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K025-M | |
| 脂质过氧化物检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K176-M | |
| CUT&RUN | CUT&RUN检测试剂盒 | Cell Signaling Technology | 86652 |
| DNA纯化缓冲液和离心柱 | Cell Signaling Technology | 14209 | |
| ddPCR | QX200微滴数字PCR系统 | Bio-Rad | -- |
| EvaGreen数字PCR预混液 | Bio-Rad | 1864034 | |
| 微滴生成油 | Bio-Rad | 1864005 | |
| 微滴生成器 | Bio-Rad | 1864002 | |
| 微滴读取仪 | Bio-Rad | 1864003 | |
| EMSA | NE-PER核蛋白和胞浆蛋白提取试剂 | Thermo Fisher | 78833 |
| LightShift化学发光EMSA试剂盒 | Thermo Fisher | 20148 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物样本采集 | 欧亚红松鼠的年龄、性别、饲养条件、采样时间（6月和10月） 阅读提示：Methods 4.1节 |
| 细胞培养与药物处理 | HFSCs来源（8周龄SD大鼠）、培养基组成（DMEM/F12+2% FBS+GlutaMAX+EGF+bFGF）、药物浓度（melatonin 1000 ng/L, SR1078 10μM, SR3335 10μM）、处理时间24小时 阅读提示：Methods 4.1节 |
| RNA-Seq分析 | 测序平台、比对软件（HISAT2）、差异表达筛选标准（padj≤0.05, log2FC≥1） 阅读提示：Methods 4.2节 |
| qPCR分析 | RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、内参基因、引物序列、2^-ΔΔCt方法 阅读提示：Methods 4.3节及补充材料 |
| 蛋白质印迹 | 抗体信息、蛋白上样量、电泳条件（4-12%或4-20%梯度胶）、转膜条件（200mA 1h） 阅读提示：Methods 4.4节及补充材料 |
| 流式细胞术 | 细胞收集方法、固定方法（70%乙醇）、染色试剂盒（FxCycle PI/RNase） 阅读提示：Methods 4.8节 |
| CUT&RUN和EMSA | 细胞数量、抗体、探针序列、竞争实验的倍数（200倍） 阅读提示：Methods 4.11和4.13节 |