临床样本分析
评估HFpEF患者循环FGF21水平及其与心脏功能的相关性。
通过免疫分析测定151例HFpEF患者和146例健康对照的血清FGF21水平，并进行相关性分析。
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FGF21通过改善小鼠心脏线粒体生物能量学保护射血分数保留的心力衰竭
FGF21 protects against HFpEF by improving cardiac mitochondrial bioenergetics in mice.
实验完整度
高包含临床样本分析、基因敲除小鼠模型、AAV介导的过表达和敲低、细胞实验及蛋白组学等多层级验证。
主要模型
HFpEF小鼠模型（HFD+L-NAME诱导） Fgf21 KO小鼠 Fgf21Adipoq小鼠 Apn KO小鼠 原代新生大鼠心室肌细胞（NRVMs） 人血清样本（151例HFpEF患者和146例健康对照）
重点核对
HFpEF模型诱导：8-10周龄雄性小鼠，HFD（D12492）加L-NAME（0.5 g/L饮水）处理12周 FGF21敲除小鼠构建：Fgf21 KO小鼠，Fgf21Adipoq小鼠（Adipoq-Cre × Fgf21F/F） AAV递送：尾静脉注射AAV-Fgf21或AAV-Pdk4或Pdk4-shRNA（cTNT启动子），处理2周 细胞处理：NRVMs用500 μM PA处理，再与rmFGF21（100 ng/mL）共孵育24小时 统计方法：两组比较用Student's t检验或Mann-Whitney U检验，多组比较用ANOVA
摘要
成纤维细胞生长因子21（FGF21）是一种具有多效性的代谢激素，对多种心脏疾病有益。然而，FGF21在射血分数保留的心力衰竭（HFpEF）中的作用仍不清楚。在此，我们显示HFpEF患者循环FGF21水平升高与心脏舒张功能呈负相关。全身性或脂肪组织FGF21 deficiency加重高脂饮食（HFD）加N[ω]-硝基-L-精氨酸甲酯（L-NAME）诱导的HFpEF小鼠的心脏舒张功能障碍和损伤，而这些效应通过FGF21补充显著逆转。机制上，FGF21增强脂联素（APN）的产生，APN继而间接作用于心肌细胞，或FGF21直接靶向心肌细胞，通过激活PI3K/AKT信号负调控丙酮酸脱氢酶激酶4（PDK4）的产生，从而促进线粒体生物能量学。此外，APN缺失显著消除FGF21对HFpEF的保护作用，而PDK4基因失活显著减轻小鼠HFpEF。因此，FGF21通过微调脂肪、肝脏和心脏之间的多器官串扰保护HFpEF。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- FGF21在HFpEF发病机制中的作用及其保护心脏的分子机制是什么？
- 核心机制
- FGF21通过APN依赖性及非依赖性途径激活PI3K/AKT信号，负调控PDK4表达，促进心肌细胞线粒体生物能量学，从而保护心脏功能。
- 主要证据
- HFpEF患者血清FGF21升高与舒张功能负相关；FGF21敲除加重HFpEF小鼠舒张功能障碍和损伤，AAV-Fgf21补充逆转；APN敲除消除FGF21保护作用；PDK4敲低改善、过表达加重HFpEF表型；蛋白组学和细胞实验显示FGF21通过PI3K/AKT-PDK4轴改善线粒体功能。
- 研究意义
- 本研究揭示FGF21-PDK4轴作为HFpEF治疗的潜在新靶点，为HFpEF管理提供靶向治疗的新途径。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
小鼠HFpEF模型构建及FGF21表达分析
建立HFpEF小鼠模型并分析FGF21在模型中的表达变化。
用HFD加L-NAME处理雄性小鼠12周构建HFpEF模型，检测血清FGF21水平及各组织FGF21蛋白含量。
FGF21功能缺失实验
明确FGF21缺失对HFpEF小鼠心脏舒张功能和损伤的影响。
对Fgf21 KO和Fgf21Adipoq小鼠进行HFpEF诱导，评估心脏功能、重塑、氧化应激和纤维化指标。
FGF21补充实验
验证补充FGF21能否改善HFpEF小鼠的心脏功能。
通过AAV-Fgf21尾静脉注射过表达FGF21，评估对HFpEF小鼠心脏功能和损伤的影响。
PDK4功能研究
探究PDK4在FGF21保护HFpEF中的下游作用。
通过AAV介导的Pdk4-shRNA敲低和AAV-Pdk4过表达，评估对HFpEF小鼠心脏功能和线粒体生物能量学的影响。
细胞机制验证
在NRVMs中验证FGF21通过PI3K/AKT信号调控PDK4并改善线粒体功能。
NRVMs用PA处理模拟损伤，给予rmFGF21、LY294002或Flag-Pdk4转染，检测相关蛋白表达和线粒体功能。
APN介导作用验证
明确APN在FGF21保护HFpEF中的中介作用。
在Apn KO小鼠中检测AAV-Fgf21的保护作用是否减弱，并在NRVMs中共培养脂肪组织验证APN的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| HFpEF模型诱导 | Nω-硝基-L-精氨酸甲酯 | Sigma | 51298-62-5 |
| 高脂饮食（D12492） | Research Diets | -- | |
| 细胞处理 | 棕榈酸 | Sigma | -- |
| 重组小鼠FGF21 | Abcam | ab63277 | |
| LY294002 | Selleck | S1105 | |
| 免疫印迹 | GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 |
| VDAC1抗体 | ABclonal | A19707 | |
| FGF21抗体 | Abcam | ab171941 | |
| 纤连蛋白抗体 | Abcam | ab45688 | |
| I型胶原抗体 | Abcam | ab260043 | |
| α-平滑肌肌动蛋白抗体 | Abcam | ab124964 | |
| PDK4抗体 | Proteintech | 12949-1-AP | |
| 磷酸化PDH抗体 | Abcam | ab177461 | |
| PDH抗体 | Proteintech | 18068-1-AP | |
| PI3K抗体 | Abmart | T40064 | |
| 磷酸化PI3K抗体 | Abmart | T40065 | |
| AKT抗体 | CST | 9272S | |
| 磷酸化AKT抗体 | CST | 12694S | |
| 总OXPHOS啮齿动物抗体 | Abcam | ab110413 | |
| CPT1b抗体 | Proteintech | 22170-1-AP | |
| ELISA | FGF21 ELISA试剂盒 | Immunoassay Services | 31180 |
| APN ELISA试剂盒 | Immunoassay Services | 32010 | |
| RNA提取和qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| Improm-II逆转录试剂盒 | Promega | A5001 | |
| 组织学分析 | H&E染色试剂盒 | Solarbio | G1120 |
| 小麦胚芽凝集素 | Sigma | L4895 | |
| DAPI | Sigma | 9542 | |
| 天狼星红 | Biohao | S1020 | |
| 油红O | Sigma | O1391 | |
| ROS检测 | 二氢乙啶 | Thermo Scientific | D11347 |
| DCFH-DA | Beyotime | S0033S | |
| 葡萄糖摄取检测 | 2-NBDG | Beyotime | ST2078 |
| 脂肪酸摄取检测 | BODIPY | Thermo Fisher Scientific | D3821 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Servicebio | G1515 |
| 线粒体形态检测 | Hoechst 33342 | Beyotime | C1022 |
| MitoTracker Green探针 | Yeasen | 40742ES50 | |
| 乙酰辅酶A测量 | 乙酰辅酶A检测试剂盒 | Elabscience | E-EL-0125 |
| ATP测量 | ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 |
| PDH活性测量 | PDH活性微板检测试剂盒 | Solarbio | BC0385 |
| 脂质含量测量 | 游离脂肪酸检测试剂盒 | Solarbio | BC0595 |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Applygen | E1013-50 | |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Nanjing Institute of Bioengineering | A110-1-10 | |
| 细胞培养 | 胶原酶II | Gibco | 17101015 |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000试剂盒 | Invitrogen | L3000150 |
| Opti-MEM培养基 | Gibco | 31985070 | |
| 蛋白质组学 | Q Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| EASY-Spray C18捕集柱 | Thermo Scientific | P/N 164946 | |
| EASY-Spray C18液相色谱分析柱 | Thermo Scientific | ES802 | |
| 蛋白质组学数据采集 | Easy nLC 1200色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| 超声心动图 | Vevo 3100超声系统 | VisualSonics | -- |
| 运动测试 | 跑步机 | Harvard Instruments | -- |
| 血压测量 | BP2000血压计 | Visitech Systems | -- |
| 转印 | PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 |
| BCA测定 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23227 |
| ECL检测 | ECL底物 | Advansta | K-12045-D50 |
| 曝光 | Amersham ImageQuant 800成像系统 | GE | -- |
| 实时荧光定量PCR | CFX96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- |
| 显微成像 | BX53F2O显微镜 | Olympus | -- |
| 细胞成像 | TI-S倒置显微镜 | Nikon | -- |
| 超分辨成像 | AIR-SIM-STORM超分辨显微镜 | Nikon | -- |
| 透射电镜 | JEM-F200透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| 细胞生物能量分析 | Seahorse XFe96细胞外流量分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| 微孔板读数 | 多功能酶标仪 | Thermo Scientific | 51119080 |
| ATP测量 | Synergy Neo2酶标仪 | Biotek | -- |
| 血糖测量 | Accu-Chek血糖仪 | Roche | -- |
| OCT包埋 | OCT包埋剂 | SAKURA | 4583 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| HFpEF模型诱导 | 小鼠品系、性别、年龄、HFD类型、L-NAME剂量、处理时间 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| 基因敲除小鼠 | Fgf21 KO、Fgf21Adipoq、Apn KO小鼠的构建和基因型确认 阅读提示：Methods: Animal experiments |
| AAV病毒注射 | AAV血清型、启动子、注射途径、剂量、时间点 阅读提示：Methods: Construction of AAV vectors |
| 细胞实验 | NRVMs分离方法、PA浓度、rmFGF21浓度、LY294002浓度、处理时间 阅读提示：Methods: NRVMs isolation and culture |
| 功能检测 | 超声心动图参数、血压测量、运动力竭测试条件 阅读提示：Methods: Echocardiography, Exercise exhaustion test, Measurement of blood pressure |