构建条件性敲除小鼠模型
在子宫内膜上皮中特异性删除Prickle1，以研究其生理功能。
使用Prickle1f/+ ES细胞创建Prickle1f/f小鼠，并与Lactoferrin-iCre转基因小鼠杂交获得Prickle1f/f Ltf+/icre cKO小鼠。
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PRICKLE1缺失导致小鼠子宫内膜上皮结构异常、胚胎着床减少和生育力降低
Loss of PRICKLE1 leads to abnormal endometrial epithelial architecture, decreased embryo implantation, and reduced fertility in mice.
实验完整度
高包含基因敲除小鼠模型、生育力与着床分析、3D成像、组织学与免疫染色、scRNA-seq及RNA velocity等多种证据层级，并包含功能与机制验证。
主要模型
Prickle1f/f Ltf+/icre 小鼠（子宫内膜上皮条件性敲除） C57BL/6 野生型雄性小鼠（用于交配） 6月龄 Prickle1f/f Ltf+/icre 和对照小鼠子宫组织
重点核对
Prickle1条件性敲除效率：通过免疫染色确认PRICKLE1表达缺失，但存在斑片状表达，提示不完全外显 生育力评估：6月龄Prickle1f/f Ltf+/icre cKO雌鼠与C57BL6 WT雄鼠交配，记录活产仔数（cKO为5.70，对照为9.36） 胚胎着床：在GD 4.5通过尾静脉注射1%芝加哥天蓝6B染料计数着床点，存在两组突变表型 子宫3D成像：使用全组织免疫荧光和共聚焦显微镜，检测腔折叠、腔关闭和腺体长度 scRNA-seq条件：6月龄小鼠（n=3每组），使用10× Genomics Chromium Single Cell 3' v3、Illumina NovaSeq 6000，数据已存入GSE272552
摘要
成功的胚胎着床需要子宫腔上皮发生协调变化，包括结构适应、顶端-基底极性转变、宫内液体重吸收和细胞通讯。平面细胞极性（PCP）蛋白对细胞组织至关重要，但在子宫生理和着床中的研究不足。PRICKLE蛋白是PCP的组成部分，被认为在上皮极化和组织形态发生中发挥关键作用。然而，它们在支持胚胎着床的极化单层子宫内膜上皮中的功能尚不清楚。我们使用乳铁蛋白-iCre开发了小鼠Prickle1的子宫内膜上皮特异性敲除，以研究其子宫生理作用。小鼠子宫内膜上皮中Prickle1的消融导致妊娠第4.5天胚胎着床减少，导致生育力降低。子宫的3D成像显示突变子宫中异常的腔折叠、腔关闭受损和腺体长度改变。此外，我们在突变子宫上皮中观察到水通道蛋白-2表达降低、细胞结构破坏以及E-钙粘蛋白表达和定位改变。腔内上皮细胞中发现了上皮-间质转化的证据，进一步将PRICKLE1缺失与子宫病理联系起来。此外，细胞分裂极性改变导致不完全胞质分裂和双核或多核细胞增加，表明PRICKLE1在上皮结构维持中的关键作用。我们的发现强调了PRICKLE1在子宫内平面细胞极性通路中的关键作用，揭示了其在成功妊娠和生育所必需的分子和细胞反应中的重要性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- PRICKLE1在子宫内膜上皮中的功能及其对胚胎着床和生育力的影响是什么？
- 核心机制
- PRICKLE1通过调节平面细胞极性（PCP）维持上皮结构，其缺失导致细胞分裂极性改变、不完全胞质分裂、双核/多核细胞形成，并促进上皮-间质转化（EMT），同时影响E-钙粘蛋白表达和定位。
- 主要证据
- 利用Prickle1f/f Ltf+/icre条件性敲除小鼠，通过生育力分析、GD 4.5着床评估、3D成像、组织学染色、免疫荧光和scRNA-seq验证，显示突变子宫出现腔折叠异常、腔关闭受损、AQP2表达降低、EMT标志物上调及细胞分裂异常。
- 研究意义
- 研究揭示了PRICKLE1在子宫PCP通路中的关键作用，为理解子宫上皮结构和功能在成功妊娠中的重要性提供了新见解，可能对相关子宫疾病的机制研究有启示。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生育力评估
评估Prickle1缺失对活产仔数和胚胎着床的影响。
将雌性cKO和对照小鼠与C57BL6 WT雄鼠交配，记录活产仔数；在GD 3.5或4.5静脉注射染料计数着床点。
子宫3D成像与形态分析
观察子宫腔折叠、腔关闭和腺体结构的变化。
对GD 4.5子宫进行全组织免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜获取Z堆栈图像，并用Imaris软件重建3D结构，分析腺体长度。
组织学和免疫染色
检查上皮细胞形态、蛋白表达和定位变化。
对子宫组织进行H&E染色和免疫荧光/免疫组化染色，检测AQP2、E-cadherin、SOX9、EMT标志物等。
基因表达分析
检测相关基因表达变化，包括生长因子、激素受体和EMT标志物。
提取子宫RNA，进行qRT-PCR分析特定基因表达。
单细胞RNA测序分析
在单细胞水平上分析细胞类型比例和基因表达变化，探究EMT和细胞重分类。
对6月龄小鼠子宫组织进行scRNA-seq，使用Seurat分析聚类，并利用RNA velocity评估细胞状态转变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因分型 | Prickle1引物 | -- | -- |
| Ltf+/icre引物 | -- | -- | |
| 着床评估 | 芝加哥天蓝6B | Millipore Sigma | C8679 |
| 全组织免疫荧光 | 抗FOXA2抗体 | Abcam | ab108422 |
| 抗CDH1抗体 | Takara Biosciences | M108 | |
| Alexa Fluor 555标记驴抗兔IgG | Invitrogen | A31572 | |
| Alexa Fluor 633标记山羊抗大鼠IgG | Invitrogen | A21094 | |
| Hoechst | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| 成像 | Leica TCS SP8 X共聚焦激光扫描显微镜 | Leica | -- |
| 图像分析 | Imaris v9.2.1 | Bitplane | -- |
| 组织学 | 抗原修复液 | Vector Labs | H-3301 |
| 免疫荧光 | 抗AQP2抗体 | Novus Biologicals | NB110-74682SS |
| 抗E-CAD抗体 | Cell Signaling | 24E10 | |
| 抗ZEB1抗体 | Cell Signaling | 70512 | |
| 抗TWIST1抗体 | Cell Signaling | 90445 | |
| 抗SNAI2抗体 | Cell Signaling | 9585 | |
| 抗PGR抗体 | Invitrogen | MA1-411 | |
| 抗PRICKLE1抗体 | BiCell Scientific | 50621 | |
| Alexa Fluor 488和594二抗 | Jackson Immuno Research Laboratories | 711-545-152, | |
| 免疫组化 | ABC Universal PLUS过氧化物酶试剂盒 | Vector Labs | PK-8200 |
| 抗KRT7抗体 | ThermoFisher Scientific | pA5-82291 | |
| 抗SOX9抗体 | Cell Signaling | 82630 | |
| 抗vimentin抗体 | Cell Signaling | D21H3 | |
| 抗ER抗体 | Proteintech | 21244-1-AP | |
| 抗dHAND抗体 | Santa-Cruz Biotechnology | sc-398167 | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL原位凋亡试剂盒 | Elabscience | E-CK-A320 |
| RNA分离 | RNAlater | Invitrogen | AM7020 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 | |
| cDNA合成 | 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| qRT-PCR | TaqMan检测（Fgf1、Fgf2等） | IDT | -- |
| Rn18s TaqMan检测 | ThermoFisher Scientific | Mm03928990_G1 | |
| 激素评估 | ELISA | -- | -- |
| scRNA-seq | 10× Chromium单细胞3' v3试剂 | 10× Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型与基因型 | Prickle1f/f Ltf+/icre cKO小鼠的构建方法，包括ES细胞系和Cre品系；基因分型引物；年龄（6月龄用于主要实验） 阅读提示：Materials and methods: Generation of Prickle1 cKO mouse |
| 生育力与着床评估 | 交配方案，阴道栓检测时间（GD 0.5），着床点计数方法（GD 4.5，Chicago Sky Blue注射），样本量（对照组n=8，突变组n=13） 阅读提示：Materials and methods: Fertility and implantation; Figure 1E-F |
| 子宫3D成像 | 全组织免疫荧光步骤（固定、抗体、清除）、成像参数（Z-stack间隔、物镜）、图像分析软件和腺体长度测量方法 阅读提示：Materials and methods: Whole-mount immunofluorescence, Confocal imaging, Image analysis |
| 组织学与免疫染色 | 组织固定与包埋、抗原修复、抗体稀释和孵育时间、检测指标 阅读提示：Materials and methods: Histology and staining |
| 基因表达分析 | RNA提取方法、qRT-PCR引物、内参、分析方法 阅读提示：Materials and methods: RNA isolation and qRT-PCR analysis |
| 单细胞RNA测序 | 样本制备、文库构建、测序平台、生物信息学分析参数（如聚类分辨率、DoubletFinder设置） 阅读提示：Materials and methods: scRNA sequencing and Single-cell data analysis |