建立G12Ci耐药细胞模型
获得对AMG510和MRTX849获得性耐药的KRASG12C突变癌细胞系。
将NCI-H358、NCI-H23、Calu-1和MIA PaCa-2细胞在浓度递增的AMG510或MRTX849中培养，直至产生耐药，最终浓度分别为10 μM和5 μM，并维持于1 μM和0.5 μM。
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MAPK-SOX2通路的再激活赋予KRASG12C抑制剂耐药肿瘤的铁死亡敏感性
Reactivation of MAPK-SOX2 pathway confers ferroptosis sensitivity in KRASG12C inhibitor resistant tumors.
实验完整度
高包含体外细胞系筛选、RNA-seq、转录因子验证（luciferase、ChIP-qPCR）、回补实验及体内异种移植瘤模型，并具备机制和功能验证。
主要模型
NCI-H358细胞及AMG510/MRTX849耐药株 Calu-1细胞及AMG510/MRTX849耐药株 NCI-H358AR异种移植瘤模型
重点核对
耐药细胞系的建立和维持浓度（AMG510 10 μM，MRTX849 5 μM） 铁死亡诱导剂处理浓度和时间 SLC7A11和SLC40A1表达水平 体内实验中SAS和Lip-1的给药剂量和方式
摘要
KRASG12C抑制剂（G12Ci）包括AMG510和MRTX849的临床成功受到最终出现的获得性耐药的限制。寻找一种新的有效治疗方法来逆转或靶向这种耐药性是当务之急。为此，我们建立了G12Ci（AMG510和MRTX849）耐药的KRASG12C突变癌细胞系，并用FDA批准的药物库进行了筛选。我们发现包括索拉非尼和拉帕替尼在内的铁死亡诱导剂在G12Ci耐药细胞中表现出明显的生长抑制作用。机制上，G12Ci耐药细胞表现出MAPK信号通路的再激活，该通路抑制了SOX2介导的胱氨酸转运体SLC7A11和铁输出蛋白SLC40A1的表达。因此，细胞内GSH水平低但铁含量高，使得这些耐药肿瘤对铁死亡诱导剂高度敏感。SOX2或SLC7A11和SLC40A1的异位过表达赋予了G12Ci耐药细胞对铁死亡的抵抗。硫唑嘌呤（SAS）诱导的铁死亡对来源于AMG510耐药的KRASG12C突变细胞的异种移植瘤的生长有明显的抑制作用。总之，我们的结果提出了一种新的治疗策略，即用铁死亡诱导剂治疗携带G12Ci耐药癌症的患者。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KRASG12C抑制剂耐药肿瘤对铁死亡诱导剂敏感性的机制及其治疗潜力。
- 核心机制
- G12Ci耐药细胞中MAPK信号再激活抑制SOX2介导的SLC7A11和SLC40A1转录，导致GSH水平降低和铁含量升高，从而增强铁死亡敏感性。
- 主要证据
- 体外耐药细胞系对铁死亡诱导剂（erastin、RSL3、SAS等）更敏感，RNA-seq显示SLC7A11和SLC40A1下调，过表达SOX2、SLC7A11和SLC40A1可逆转敏感性，体内异种移植瘤模型证实SAS抑制耐药肿瘤生长。
- 研究意义
- 提出诱导铁死亡可能是一种治疗G12Ci耐药癌症的有前景的策略，但需进一步临床前和临床评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药物筛选
鉴定能抑制G12Ci耐药细胞生长的化合物。
使用CCK8法对Calu-1AR和Calu-1MR细胞进行FDA批准药物库（约100种化合物，10 μM，24小时）筛选，发现铁死亡诱导剂索拉非尼和拉帕替尼优先抑制耐药细胞。
验证耐药细胞对铁死亡的敏感性
确认G12Ci耐药细胞对多种铁死亡诱导剂更敏感。
用erastin、RSL3、SAS、JKE-1674处理亲本和耐药细胞，检测细胞活力、GSH/GSSG比值、MDA含量、脂质过氧化（C11-BODIPY）和细胞形态。
转录组分析
识别耐药细胞中差异表达的基因，尤其是铁死亡相关基因。
对亲本和AR细胞（NCI-H358和Calu-1）进行RNA-seq，鉴定出SLC7A11和SLC40A1显著下调，GPX4变化不大。
验证SLC7A11和SLC40A1的作用
验证SLC7A11和SLC40A1下调是否导致耐药细胞的铁死亡敏感性。
在NCI-H358AR细胞中过表达SLC7A11和SLC40A1，检测细胞对erastin和RSL3的敏感性，发现过表达可部分逆转敏感性。
鉴定上游转录因子SOX2
确定调控SLC7A11和SLC40A1表达的转录因子。
利用ChEA3数据库分析共同下调基因，发现SOX2是富集的转录因子。验证SOX2在耐药细胞中表达下调，且能结合并激活SLC7A11和SLC40A1启动子（luciferase、ChIP-qPCR）。
验证SOX2调控铁死亡敏感性
确认SOX2过表达能否逆转耐药细胞的铁死亡敏感性。
在NCI-H358AR细胞中过表达SOX2，检测SLC7A11和SLC40A1表达、GSH水平及对erastin/RSL3的敏感性，发现过表达增加耐药性。
验证MAPK信号调控SOX2
阐明MAPK再激活如何抑制SOX2表达。
用MEK抑制剂U0126或shRNA敲低ERK1/2处理耐药细胞，检测SOX2、SLC7A11和SLC40A1表达，发现抑制MAPK信号恢复这些基因表达，并降低铁死亡敏感性。
体内验证铁死亡诱导剂的治疗效果
评估铁死亡诱导剂SAS对G12Ci耐药肿瘤生长的抑制作用。
将NCI-H358AR细胞皮下接种裸鼠，当肿瘤体积达100 mm3时，腹腔注射SAS或SAS+liproxstatin-1，测量肿瘤体积和重量，并进行免疫组化检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | AMG510 | MedChemExpress | HY-114277 |
| MRTX849 | MedChemExpress | HY-130149 | |
| 索拉非尼 | MedChemExpress | HY-10201 | |
| 拉帕替尼 | MedChemExpress | HY-50898 | |
| Erastin | MedChemExpress | HY-15763 | |
| RSL3 | MedChemExpress | HY-100218A | |
| 柳氮磺吡啶 | MedChemExpress | HY-14655 | |
| JKE-1674 | MedChemExpress | HY-138153 | |
| Liproxstatin-1 | MedChemExpress | HY-12726 | |
| U0126 | MedChemExpress | HY-12031A | |
| 甲磺酸去铁胺 | MedChemExpress | HY-B0988 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | SenBeiJia Biological Technology | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| MycoBlue支原体检测试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | MedChemExpress | HY-15695 |
| 潮霉素 | MedChemExpress | HY-B0490 | |
| 分子克隆 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | 23966 |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR1003 | |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo | L3000008 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | ApexBio Technology | K1018 |
| 衰老检测 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
| MDA检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| 蛋白定量 | BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| 铁含量检测 | 总铁含量比色检测试剂盒 | Applygen Technologies Inc | E1042-100 |
| 半胱氨酸检测 | 半胱氨酸比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K352 |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY™ 581/591 C11探针 | Thermo | D3861 |
| 流式分析 | Accuri 6流式细胞仪 | BD Bioscience | -- |
| RNA提取 | RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 |
| cDNA合成 | Hifair AdvanceFast第一链cDNA合成试剂盒 | Yeasen | 11141ES60 |
| RT-qPCR | Eastep qPCR预混液 | Promega | LS2062 |
| 蛋白印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| SOX2抗体 | Cell Signaling Technology | 23064 | |
| pERK1/2抗体 | Abclonal | AP0974 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| SLC40A1抗体 | Abclonal | A14885 | |
| Vinculin抗体 | Abclonal | A2752 | |
| KRAS抗体 | Proteintech | 12063-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 4-HNE抗体 | JaICA | MHN-020P | |
| 荧光素酶检测 | 荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E1501 |
| ChIP | EZ-Magna ChIP A/G染色质免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17-10086 |
| 组织学 | SignalStain DAB底物试剂盒 | Cell Signaling Technology | 8059 |
| 免疫组化 | Ki67抗体 | Abcam | ab15580 |
| HPLC分析 | Ultra Aqueous C18色谱柱 | Restek | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 耐药细胞建立 | 药物浓度递增方案、最终浓度（AMG510 10 μM，MRTX849 5 μM）、维持浓度（1 μM和0.5 μM） 阅读提示：Materials and methods, section 2.3 |
| 药物处理 | 药物浓度、处理时间（如erastin 5 μM, 18h; RSL3 2 μM, 12h; SAS 1 mM, 24h等） 阅读提示：Figure 2 legend and supplementary figures |
| 分子机制验证 | SOX2、SLC7A11、SLC40A1表达水平及MAPK信号状态 阅读提示：Results sections 3.2-3.4 and corresponding figures |
| 体内实验 | 小鼠品系（BALB/c裸鼠）、细胞接种量（2×10^6）、给药剂量（SAS和Lip-1具体剂量未明确）、给药频率（隔天）、肿瘤体积测量方法 阅读提示：Materials and methods, section 2.18 and Figure 6 legend |