验证REGγ缺失促进焦亡
探究REGγ对焦亡的影响
在HeLa细胞中敲低REGγ，用顺铂诱导焦亡，检测细胞死亡形态、LDH释放和GSDME切割；在原代BMDMs中用LPS+ATP诱导焦亡，检测LDH释放、Annexin V/PI染色和GSDMD切割。
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Bim的泛素非依赖性降解阻断脓毒症相关组织损伤中的巨噬细胞焦亡
Ubiquitin-independent degradation of Bim blocks macrophage pyroptosis in sepsis-related tissue injury.
实验完整度
高包含细胞实验（HeLa、BMDMs等）、动物模型（CLP、PA感染、REGγ敲除鼠）、临床样本（脓毒症患者PBMCs）等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HeLa细胞 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） CLP诱导的脓毒症小鼠模型 脓毒症患者外周血单个核细胞（PBMCs）
重点核对
REGγ敲低或敲除对焦亡的影响（HeLa shREGγ、REGγ-/- BMDMs） Bim敲除对REGγ缺失诱导焦亡的缓解作用 REGγ与Bim的相互作用及降解机制 CLP或PA感染模型中REGγ的表达变化 脓毒症患者样本中REGγ的表达变化
摘要
焦亡是一种典型的炎症性细胞死亡模式，越来越多的证据表明其在脓毒症等炎症性疾病中具有治疗价值。然而，脓毒症的机制和治疗靶点仍不清楚。在此，我们报道REGγ抑制通过调节巨噬细胞中gasdermin家族成员促进焦亡。机制上，REGγ直接降解Bim（Bcl-2家族成员，可抑制GSDMD/E的切割），最终阻止焦亡的发生。此外，盲肠结扎穿刺（CLP）诱导的脓毒症模型小鼠在RNA和蛋白质水平均显示REGγ下调。在REGγ敲除小鼠中，gasdermin介导的焦亡增强，且这些小鼠表现出更严重的脓毒症相关组织损伤。更重要的是，我们发现REGγ在临床脓毒症样本（如铜绿假单胞菌（PA）感染患者）中表达下调。最后，PA感染小鼠的肺组织中REGγ水平降低。总之，我们的研究揭示REGγ-Bim-GSDMD/E通路是脓毒症相关组织损伤中焦亡的新型调控机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- REGγ如何通过调节焦亡影响脓毒症相关组织损伤？
- 核心机制
- REGγ通过泛素非依赖性途径降解Bim，抑制GSDMD/E的切割，从而抑制巨噬细胞焦亡；REGγ缺失导致Bim积累，增强焦亡，加重脓毒症。
- 主要证据
- 细胞实验显示REGγ缺失增强GSDME/GSDMD介导的焦亡，Bim敲除缓解该效应；体内实验显示REGγ敲除小鼠CLP后组织损伤更严重，临床样本中REGγ下调。
- 研究意义
- 揭示了REGγ-Bim-GSDMD/E轴在脓毒症相关组织损伤中的调控作用，为脓毒症治疗提供潜在新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Bim在REGγ调控焦亡中的作用
探究Bim是否是REGγ调控焦亡的关键下游分子
在HeLa细胞中敲除Bim，结合REGγ敲低，检测顺铂诱导的焦亡变化；在Bim条件敲除小鼠的BMDMs中检测LPS+ATP诱导的GSDMD切割。
验证REGγ直接降解Bim的机制
验证Bim是否为REGγ的底物
通过免疫共沉淀验证REGγ与Bim结合，CHX实验检测Bim稳定性，体外降解实验确认REGγ-20S蛋白酶体直接降解Bim。
建立CLP诱导的脓毒症小鼠模型并检测REGγ表达
观察脓毒症中REGγ的表达变化
对小鼠进行CLP手术，检测组织水肿、H&E染色、血清ALT/CK/BUN水平，并通过Western blot、qPCR和免疫荧光检测REGγ表达。
验证REGγ敲除对脓毒症的影响
探究REGγ在脓毒症中的作用
对REGγ-/-和WT小鼠进行CLP，比较存活率、体重、炎症因子水平、器官损伤和巨噬细胞焦亡。
分析临床脓毒症样本中REGγ表达
验证REGγ在人类脓毒症中的表达变化
利用GEO数据库RNA-seq数据分析脓毒症患者血液中REGγ表达，并收集临床样本提取PBMCs检测REGγ蛋白水平；用PA感染小鼠模型验证。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Sunrise | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | -- | |
| MEM培养基 | Invitrogen | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | -- | |
| 细胞处理 | 顺铂 | Sigma-Aldrich | P4393 |
| 脂多糖 | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| 三磷酸腺苷 | Sigma-Aldrich | A2383 | |
| 细胞死亡检测 | Hoechst 33342/PI双染试剂盒 | -- | -- |
| Annexin V-APC/PI凋亡试剂盒 | Elabscience | E-CK-A217 | |
| 乳酸脱氢酶释放检测试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 流式分析 | APC/Cy7 zombie NR染料 | Biolegend | -- |
| PerCP/Cy5.5抗小鼠CD45抗体 | Biolegend | -- | |
| FITC抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | -- | |
| LSRFortessa流式细胞仪 | BD Bioscience | -- | |
| Western blot | 抗DFNA5/GSDME-N端抗体 | Abcam | ab215191 |
| 抗GSDMD抗体 | Abcam | ab209845 | |
| 抗REGγ抗体 | Abcam | ab157157 | |
| 抗Mcl-1抗体 | Abcam | ab32087 | |
| 抗Bcl-2抗体 | Abcam | ab182858 | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗caspase-1抗体 | Abmart | T510200 | |
| 抗Bim抗体 | Cell Signaling Technology | 2933 | |
| 抗Bad抗体 | Cell Signaling Technology | 9239 | |
| 抗Puma抗体 | Cell Signaling Technology | 98672 | |
| 抗Bid抗体 | Cell Signaling Technology | 2003 | |
| 抗Bak抗体 | Cell Signaling Technology | 12105 | |
| 抗Bax抗体 | Cell Signaling Technology | 2772 | |
| 抗Bcl-xL抗体 | Cell Signaling Technology | 2764 | |
| 抗PARP抗体 | Cell Signaling Technology | 9542 | |
| 抗caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | MBL | M177-3 | |
| 抗Flag标签抗体 | MBL | M185-3L | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000075 |
| RNA提取与qPCR | RNAiso Plus总RNA提取试剂 | Takara | 9109 |
| Superscript II逆转录酶 | Vazyme | R222-01 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | Vazyme | Q711-03 | |
| 动物实验 | Bimflox/floxLysM+/+小鼠 | GemPharmatech Co., Ltd | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养条件 | 细胞系来源（ATCC）、培养基成分（DMEM/MEM+10%FBS+1%青霉素/链霉素）、培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and methods, Cell lines section |
| 焦亡诱导和检测 | HeLa细胞用40 μM顺铂处理时间（6h, 8h, 12h, 14h）；BMDMs用1 μg/mL LPS预刺激，然后5 mM ATP处理6-12小时；LDH释放检测、Hoechst/PI染色、流式细胞术 阅读提示：Materials and methods, Assays of cell death and flow cytometry; Figure legends 1 and 2 |
| Bim敲除 | CRISPR-Cas9靶向Bim的guide RNA序列；lentiCRISPR-V2-Hygromycin载体；转染293T细胞后感染HeLa shN/shREGγ细胞；潮霉素筛选浓度和时间 阅读提示：Materials and methods, CRISPR–Cas9 deletion of Bim |
| 蛋白质相互作用和降解实验 | Co-IP：293T细胞转染Flag-REGγ和HA-Bim（各4μg和2μg），裂解缓冲液（0.2% NP-40）和抗Flag beads；CHX处理HeLa shN/shREGγ细胞浓度为100 μg/mL；体外降解：TNT Quick系统翻译Bim，与纯化的REGγ和20S蛋白酶体在37°C孵育4小时 阅读提示：Materials and methods, Western blot, co-immunoprecipitation and in vitro degradation assay; Figure 3 legend |
| 动物模型 | CLP模型：6-10周龄C57BL/6雄性小鼠，经中位结扎并20G针穿刺；PA感染模型：腹腔注射2×10^5和1×10^6 CFU/mL PA；顺铂模型：腹腔注射10 mg/kg 阅读提示：Materials and methods, Animal studies; Figure legends 4, 5, 6 |
| 临床样本 | 脓毒症诊断标准：SEPSIS-3；健康对照组；PBMCs提取；GEO数据集编号（GSE69063, GSE100159, GSE32707） 阅读提示：Materials and methods, Human samples; Figure 5 legend |