EB对胰腺癌细胞体外功能的影响
评估EB对胰腺癌细胞活力、增殖、迁移和侵袭的抑制作用。
使用CCK8检测细胞活力，EdU染色检测DNA合成，集落形成实验检测增殖能力，划痕实验和Transwell实验检测迁移和侵袭能力，并以奥沙利铂作为阳性对照。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Eupalinolide B通过ROS生成和潜在铜死亡抑制胰腺癌
Eupalinolide B suppresses pancreatic cancer by ROS generation and potential cuproptosis.
实验完整度
高包含体外细胞功能实验（CCK8、EdU、集落形成、划痕、Transwell）、体内异种移植瘤模型、RNA-seq转录组分析及机制验证（铜离子检测、蛋白表达、FDX1敲低等）。
主要模型
PANC-1人胰腺癌细胞系 MiaPaCa-2人胰腺癌细胞系 PANC-1异种移植裸鼠模型
重点核对
EB处理浓度梯度 EB对胰腺癌细胞与正常细胞HPNE的选择性毒性 EB引起ROS水平升高，NAC可抑制 EB增加细胞内铜离子水平，TTM可逆转细胞死亡 FDX1敲低后EB诱导的细胞死亡被部分逆转
摘要
胰腺癌是高度致命的恶性肿瘤，有效的治疗方法有限。本研究探讨了从林泽兰中提取的eupalinolide B（EB）对胰腺癌细胞的治疗作用。通过细胞功能实验，我们观察到EB能有效抑制细胞活力、增殖、迁移和侵袭。在异种移植小鼠模型中，EB治疗导致胰腺癌肿瘤生长减少和Ki-67表达降低。机制上，EB诱导凋亡、升高活性氧（ROS）水平并破坏铜稳态。RNA测序（RNA-seq）和基因集富集分析（GSEA）确定了铜离子结合途径和潜在参与铜死亡。此外，EB增强了elesclomol（ES）的细胞毒性作用，以铜依赖的方式增加ROS水平并表现出协同细胞毒性。这些发现表明，EB单独或与ES联合使用，是靶向金属离子失调和诱导胰腺癌潜在铜死亡的有前景的策略，可能改善治疗结果。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探究eupalinolide B对胰腺癌细胞的作用及其潜在分子机制，特别是是否通过铜死亡途径。
- 核心机制
- EB通过诱导ROS产生和增加细胞内铜离子水平，调节铜死亡相关蛋白（HSP70上调、LIAS下调），并依赖FDX1介导铜死亡，从而抑制胰腺癌细胞增殖。
- 主要证据
- 体外实验显示EB抑制细胞活力、增殖、迁移和侵袭；体内实验显示EB抑制肿瘤生长并降低Ki-67表达；RNA-seq显示铜离子结合通路富集；FDX1敲低逆转EB诱导的细胞死亡。
- 研究意义
- 研究表明EB单独或与ES联合可作为靶向金属离子失调和诱导潜在铜死亡的胰腺癌治疗策略，可能改善治疗效果。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EB对异种移植瘤模型肿瘤生长的影响
验证EB在体内的抗肿瘤效果。
建立PANC-1细胞异种移植裸鼠模型，腹腔注射不同剂量EB，测量肿瘤体积和重量，并通过H&E染色和Ki-67免疫组化评估肿瘤组织。
EB诱导细胞死亡的机制初步探究
识别EB诱导细胞死亡的模式。
使用多种抑制剂（Nec-1、Fer-1、Z-Vad-FMK、3-MA、DFO、TTM、NAC）处理EB暴露的细胞，检测细胞活力；并通过流式细胞术和荧光成像检测ROS水平。
转录组分析（RNA-seq）
揭示EB处理后胰腺癌细胞中差异表达基因和富集通路。
对PANC-1细胞进行DMSO或10μM EB处理24小时，提取RNA进行RNA-seq，利用limma包分析差异表达基因（p<0.05, logFC>1.5），并使用clusterProfiler进行KEGG和GSEA分析。
EB对铜离子水平和铜死亡相关蛋白的影响
验证EB是否影响细胞内铜水平及铜死亡相关蛋白表达。
采用铜比色法、ICP-MS和铜离子探针检测细胞内铜水平；Western blot检测HSP70、LIAS和FDX1蛋白表达；并进行FDX1敲低实验观察对细胞死亡的影响。
铜离子调节对EB诱导细胞死亡的影响
验证铜离子在EB诱导细胞死亡中的作用。
使用CuCl2和TTM干预EB处理的细胞，检测细胞活力、ROS水平和铜死亡相关蛋白表达。
EB与ES协同作用及铜离子调节
评估EB与ES联合使用对胰腺癌细胞功能的影响，并验证铜离子在其中的作用。
CCK8检测细胞活力，EdU、集落形成、划痕和Transwell实验评估联合处理对增殖、迁移和侵袭的影响；并检测CuCl2和TTM对联合处理下细胞活力、ROS和蛋白表达的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | C11995500B |
| 胎牛血清 | ExCell Bio | FSP500 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Servicebio | G4250 | |
| 药物处理 | Eupalinolide A | ChemFaces | CFN90381 |
| Eupalinolide O | ChemFaces | CFN91839 | |
| Eupalinolide B | AbMole | M4619 | |
| Elesclomol | Selleck | S1052 | |
| 抑制实验 | Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 |
| SP600125 | Selleck | S1460 | |
| 甲磺酸去铁胺 | Selleck | S5742 | |
| 3-甲基腺嘌呤 | Selleck | S2767 | |
| Necrostatin-1 | Selleck | S8037 | |
| Ferrostatin-1 | Selleck | S7243 | |
| 阳性对照 | 奥沙利铂 | Selleck | S1224 |
| 抗氧化剂 | N-乙酰半胱氨酸 | MedChemExpress | HY-B0215 |
| 铜螯合剂 | 四硫代钼酸铵 | MedChemExpress | HY-W076067 |
| 铜离子检测 | 铜离子探针CS1 | MedChemExpress | HY-141511 |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000015 |
| 溶剂 | 二甲基亚砜 | MP Biomedicals | 196055 |
| 铜含量检测 | 细胞铜比色检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K775-M |
| 增殖检测 | EdU Apollo567体外检测试剂盒 | Ribo Bio | C10310-1 |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | NCM Biotech | C6005 |
| 凋亡检测 | FITC Annexin V检测试剂盒 | KEYGEN BIOTECH | KGA108 |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒（H2DCFDA） | KEYGEN BIOTECH | KGA7501 |
| 免疫印迹 | LIAS多克隆抗体 | proteintech | 11577-1-AP |
| HSP70多克隆抗体 | proteintech | 10995-1-AP | |
| FDX1多克隆抗体 | proteintech | 12592-1-AP | |
| 磷酸化MAPK家族抗体套装 | CST | 9910T | |
| MAPK家族抗体套装 | CST | 9926T | |
| GAPDH抗体 | CST | 5174 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG(H+L) | proteintech | SA00001-2 | |
| 免疫组化 | Ki-67抗体 | ZSGB-BIO | ZM-0166 |
| 免疫印迹 | Caspase-3抗体 | CST | 14220 |
| Cleaved Caspase-3抗体 | CST | 9661 | |
| Caspase-9抗体 | CST | 9508 | |
| Cleaved Caspase-9抗体 | CST | 20750 | |
| PARP抗体 | CST | 9542 | |
| GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| ACSL4抗体 | proteintech | 22401-1-AP | |
| β-微管蛋白抗体 | CST | 2146 | |
| Western blot | Rneasy mini plus试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA-seq | Hieff NGS™ MaxUp双模式mRNA文库制备试剂盒 | -- | -- |
| Trizol试剂 | -- | -- | |
| Western blot | 裂解液 | Beyotime | P0013 |
| 蛋白酶体抑制剂 | KeyGEN | KGP603 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23227 | |
| PVDF膜 | Mili | IPVH00010 | |
| 细胞培养 | OPTI-MEM培养基 | -- | -- |
| 细胞铜含量检测 | Agilent 7850电感耦合等离子体质谱仪 | Agilent Technologies | 7850 |
| 显微镜 | 倒置显微镜 | Leica | Leica |
| 荧光显微镜 | 荧光倒置显微镜 | Nikon | Nikon-Ti2-U |
| 细胞培养 | CO2恒温培养箱 | ESCO | CLM-170B-8-CN |
| 生物安全柜 | ESCO | AC2-4S8-CN | |
| 凝胶成像 | 凝胶成像系统 | Bio-rad | ChemiDoc™ |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦显微镜 | Zeiss | LSM900 |
| 病理切片扫描 | 病理切片扫描仪 | TissueGnostics | TissueFAXS |
| 金属浴 | 振荡恒温金属浴 | Thermo | TUS-200P |
| 天平 | 分析天平 | OHAUS | EX623ZH |
| 离心机 | 冷冻离心机 | Eppendorf | 5425R |
| 冰箱 | 4°C冰箱 | Meiling | YC-525L |
| -20°C冰箱 | Haier | DW-40L508J | |
| -80°C冰箱 | CryoCube | CryoCube | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | BD | FACSMelody |
| 水浴锅 | 水浴锅 | BLUEPARD | BWS-27 |
| 分光光度计 | 紫外分光光度计 | Tecan | infinite |
| 离心机 | 离心机 | Thermo | Sorvall |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞接种密度、EB处理浓度和时间、CCK-8孵育时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Cell viability assay' |
| 集落形成实验 | 细胞接种密度、EB处理浓度和处理时间、集落培养时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Colony formation assay' |
| 细胞增殖检测 | 细胞接种密度、EB浓度、EdU孵育浓度和时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Cell proliferation assay' |
| 划痕实验 | 细胞生长状态、EB处理浓度和时间、划痕后观察时间点 阅读提示：见STAR★Methods中'Cell scratch assay' |
| Transwell侵袭实验 | Matrigel稀释比例、细胞接种密度、EB处理浓度和时间、侵袭时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Transwell invasion assay' |
| Western blot | 蛋白提取方法、抗体稀释比例、孵育条件 阅读提示：见STAR★Methods中'Western blot' |
| RNA-seq | EB处理浓度和时间、RNA提取方法、文库构建试剂盒、测序平台 阅读提示：见STAR★Methods中'RNA-seq' |
| 裸鼠异种移植瘤模型 | 小鼠品系、年龄、性别、细胞接种数量、EB给药剂量、频率和途径、治疗时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Nude mouse xenograft tumor model' |
| ROS检测 | H2DCFDA浓度、孵育时间、EB处理浓度和时间 阅读提示：见STAR★Methods中'ROS/apotosis assay' |
| 铜离子检测 | 比色法试剂盒、ICP-MS参数、CS1探针浓度和孵育时间 阅读提示：见STAR★Methods中'Cell copper colorimetric assay'、'Measurement of intracellular copper ion content by ICP-MS'和'Measurement of intracellular copper ion content by fluorescent imaging' |