建立小鼠植入物相关金黄色葡萄球菌骨髓炎模型
模拟临床感染性骨髓炎，观察疾病进展和巨噬细胞反应
在C57BL/6小鼠右股骨钻孔后注射S. aureus悬液或PBS，并植入自攻螺钉，术后给予庆大霉素。
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SLC7A11的异常表达损害小鼠金黄色葡萄球菌骨髓炎中巨噬细胞的抗菌活性
Aberrant Expression of SLC7A11 Impairs the Antimicrobial Activities of Macrophages in Staphylococcus Aureus Osteomyelitis in Mice.
实验完整度
高包含体外BMDM感染模型、小鼠体内植入物相关骨髓炎模型、SLC7A11基因敲除小鼠、转录组和蛋白质组测序，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠植入物相关金黄色葡萄球菌骨髓炎模型 原代小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） Lyz2Cre-Slc7a11f/f巨噬细胞特异性敲除小鼠
重点核对
S. aureus感染剂量：2×10^5 CFU/mL，3 µL erastin给药剂量：30 mg/kg体重，隔日一次 PD-L1抗体给药剂量：200 µg/小鼠，隔日一次 BMDM感染复染指数：MOI=10 erastin处理浓度：5 µM
摘要
金黄色葡萄球菌（S. aureus）在巨噬细胞中的持续存在，可能是慢性骨髓炎复发的储库，导致治疗的耐药性和失败。由于S. aureus在巨噬细胞中存活的机制仍 largely unknown，目前尚无获批的治疗方法。在此，在小鼠S. aureus骨髓炎模型中，我们鉴定了CD11b+F4/80+巨噬细胞中SLC7A11在转录组和翻译组中均显著上调，并验证了SLC7A11主要分布在S. aureus脓肿周围的F4/80+细胞中。重要的是，药理学抑制或基因敲除SLC7A11可促进巨噬细胞的杀菌功能，减少骨内细菌负荷，并改善S. aureus骨髓炎小鼠的骨结构。机制上，异常表达的SLC7A11下调细胞内ROS水平并减少脂质过氧化，导致巨噬细胞杀菌功能受损。有趣的是，阻断SLC7A11进一步通过ROS-NF-κB轴激活PD-L1的表达，同时靶向SLC7A11和PD-L1的联合治疗显著增强了体外和体内清除S. aureus的功效。我们的发现表明，同时靶向SLC7A11和PD-L1是一种有前景的治疗方法，可重编程巨噬细胞的杀菌功能并促进S. aureus骨髓炎中的细菌清除。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SLC7A11在金黄色葡萄球菌骨髓炎中是否以及如何影响巨噬细胞的抗菌功能？
- 核心机制
- SLC7A11异常表达下调细胞内ROS水平并减少脂质过氧化，从而损害巨噬细胞的杀菌功能；阻断SLC7A11通过ROS-NF-κB轴进一步上调PD-L1表达，联合阻断可增强抗菌效果。
- 主要证据
- 在小鼠骨髓炎模型和BMDM中，SLC7A11上调与巨噬细胞杀菌功能受损相关；药理学抑制或基因敲除SLC7A11可增强ROS和脂质过氧化，降低细菌负荷并改善骨结构，且联合PD-L1阻断效果更佳。
- 研究意义
- 研究表明同时靶向SLC7A11和PD-L1可能是一种有前景的免疫调节策略，用于治疗亚急性或慢性金黄色葡萄球菌骨髓炎。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估骨髓炎进展和巨噬细胞募集
观察感染后不同时间点骨破坏和巨噬细胞浸润情况
通过H&E染色、免疫荧光和菌落计数评估骨组织病理、S. aureus分布和Lyz2+巨噬细胞募集。
巨噬细胞转录组和蛋白质组分析
鉴定与巨噬细胞抗菌功能受损相关的差异表达基因
分选CD11b+F4/80+巨噬细胞，进行RNA测序和TMT定量蛋白质组学分析。
验证SLC7A11在感染巨噬细胞中的表达
确认SLC7A11在感染后的表达变化和细胞定位
通过免疫组化、流式细胞术和免疫荧光检测SLC7A11在骨髓巨噬细胞、中性粒细胞和单核细胞中的表达。
体外验证SLC7A11对巨噬细胞杀菌功能的影响
检测SLC7A11抑制或敲低对BMDM杀菌能力及ROS、脂质过氧化的影响
用erastin或si-Slc7a11处理BMDM，然后感染S. aureus，测定胞内菌荷、ROS水平、MDA含量和脂质过氧化。
体内验证SLC7A11抑制或敲除对骨髓炎的影响
评估药理学抑制或巨噬细胞特异性敲除SLC7A11对细菌负荷和骨结构的影响
用erastin处理野生型小鼠，或使用Lyz2Cre-Slc7a11f/f小鼠，建立骨髓炎模型，评估细菌负荷、组织学评分和micro-CT参数。
探究SLC7A11对PD-L1表达的调节机制
验证SLC7A11是否通过ROS-NF-κB轴影响PD-L1表达
在BMDM中敲低或敲除SLC7A11，感染S. aureus，检测PD-L1表达和NF-κB磷酸化，并加入ROS调节剂或NF-κB抑制剂。
联合阻断SLC7A11和PD-L1的治疗效果评估
检测联合治疗对巨噬细胞杀菌和骨髓炎小鼠骨修复的协同作用
在体外BMDM杀菌实验和体内骨髓炎模型中，单独或联合使用erastin和PD-L1抗体，评估细菌负荷和组织学改善。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 胰蛋白酶大豆肉汤 | -- | -- |
| 动物模型 | 三溴乙醇 | -- | -- |
| 庆大霉素 | -- | -- | |
| Erastin | MedChemExpress | -- | |
| PD-L1中和抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| SLC7A11抗体 | Abcam | ab307601 | |
| PD-L1抗体 | Abcam | ab279292 | |
| F4/80抗体 | Bio-Rad | AS-MCA497GA | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | #4412 | |
| Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | #8890 | |
| Dylight 488标记的山羊抗大鼠IgG | Abbkine | A23240 | |
| 免疫组织化学 | HRP标记的二抗 | Huabio | HA1001 |
| DAB显色试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9018 | |
| 流式分选 | 抗小鼠CD16/32抗体 | Biolegend | #101319 |
| 抗小鼠CD11b-BV421 | Biolegend | #101235 | |
| 抗小鼠F4/80-APC/Fire 750 | Biolegend | #123152 | |
| 流式分析 | 抗CD11b-FITC | Biolegend | #101205 |
| 抗F4/80-APC/Fire 750 | Biolegend | #123151 | |
| 抗Ly6G-BV510 | Biolegend | #127633 | |
| 抗Ly6C-PerCP | Biolegend | #128027 | |
| Alexa Fluor 647标记的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | #4414 | |
| Western blot | SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| p-NF-κB抗体 | Affinity | AF2006 | |
| NF-κB抗体 | Affinity | AF5006 | |
| PD-L1抗体 | Proteintech | 17952-1-AP | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| L929成纤维细胞条件培养基 | -- | -- | |
| 溶葡萄球菌素 | -- | -- | |
| DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | -- | |
| Hoechst染料 | -- | -- | |
| RT-qPCR | RNAiso PLUS试剂 | -- | -- |
| Evo M-MLV反转录预混试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| RNA干扰 | 靶向Slc7a11的小干扰RNA | Sangon Biotech | -- |
| EndoFectin转染试剂 | Genecopoeia | -- | |
| 脂质过氧化检测 | Image-iT脂质过氧化检测试剂盒 | Thermo Fisher | -- |
| C11-BODIPY 581/591荧光探针 | -- | -- | |
| 丙二醛比色检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| Micro-CT | SkyScan1276显微CT | Bruker | -- |
| RNA测序 | Illumina Novaseq6000测序仪 | Illumina | -- |
| 蛋白质组学 | Orbitrap Fusion质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌准备 | S. aureus菌株来源及培养条件，包括培养基、温度、转速和时间；感染用细菌浓度和体积。 阅读提示：Materials and Methods: Bacterial culture and quantification |
| 动物模型建立 | 小鼠品系、年龄、性别；麻醉方式；手术步骤：钻孔、注射菌量、植入物；术后抗生素使用。 阅读提示：Materials and Methods: Mouse models |
| 药物处理 | erastin给药剂量、频率、途径；PD-L1抗体给药剂量、频率、途径；治疗开始时间和持续时间。 阅读提示：Materials and Methods: Mouse models |
| 巨噬细胞分离和培养 | BMDM分离方法、培养条件和成熟时间；感染时MOI、感染时间、去除胞外菌的方法。 阅读提示：Materials and Methods: Mouse BMDMs culture and intracellular ROS detection |
| 药物处理（体外） | erastin、NAC、BSO、ferrostatin-1、PD-L1抗体的处理浓度、预处理时间和处理时间点。 阅读提示：Figure legends 3 and 7; Materials and Methods: Intracellular killing assay |
| 检测指标 | ROS检测使用的探针、浓度和孵育时间；脂质过氧化检测使用的探针或MDA试剂盒；细菌负荷测定方法。 阅读提示：Materials and Methods: Mouse BMDMs culture and intracellular ROS detection; Lipid peroxidation; Intracellular killing assay |