S100A6表达模式分析
确定S100A6在早期妊娠小鼠子宫中的表达位置和时间。
通过原位杂交、免疫荧光、RT-qPCR和Western blot检测妊娠第1-8天子宫中S100A6的表达。
Blastocyst-Derived Lactic Acid May Regulate S100A6 Expression and Function in Mouse Decidualization via Stimulation of Uterine Epithelial Arachidonic Acid Secretion.
包含体内小鼠模型(妊娠、假孕、延迟着床、卵巢切除)和体外细胞实验(分离培养、敲低/过表达、抑制剂),并进行功能验证和机制验证。
小鼠子宫内膜上皮细胞和基质细胞原代培养 小鼠妊娠/假孕模型 小鼠延迟着床和激活模型 卵巢切除小鼠模型
小鼠品系CD1,6-8周龄 妊娠第1-8天,假孕第4天 乳酸处理浓度20 mM,处理3小时 AA处理浓度20 μM,处理3小时 孕酮剂量1 mg/只,皮下注射 雌激素剂量100 ng/只(或25 ng/只激活延迟着床)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定S100A6在早期妊娠小鼠子宫中的表达位置和时间。
通过原位杂交、免疫荧光、RT-qPCR和Western blot检测妊娠第1-8天子宫中S100A6的表达。
验证活性囊胚是否诱导S100A6表达。
比较假孕第4天与妊娠第4天、延迟着床与激活着床、着床点与非着床点S100A6表达。
探讨囊胚来源乳酸是否通过AA/COX2/PGI2/PPARδ通路诱导S100A6表达。
用乳酸处理上皮细胞检测p-cPLA2和AA分泌;用AA、Iloprost、GW501516及抑制剂处理基质细胞检测S100A6及相关蛋白;共培养实验验证细胞间通讯。
验证S100A6是否影响小鼠体外蜕膜化。
通过siRNA敲低和过表达S100A6,检测蜕膜化标志物Prl8a2及上皮间质转化相关蛋白。
验证S100A6是否通过RAGE/EGFR/ERK1/2通路调节蜕膜化。
在S100A6过表达细胞中,使用RAGE抑制剂FPS-ZM1、EGFR抑制剂和U0126处理,检测Prl8a2及通路蛋白磷酸化水平。
验证孕酮和雌激素是否通过其受体调节S100A6表达。
在卵巢切除小鼠中分别注射孕酮、雌激素及相应受体拮抗剂或激动剂,检测S100A6表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物处理 | 芝加哥蓝染料 | Sigma-Aldrich | C8679 |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | E1024 | |
| 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | E8875 | |
| 芝麻油 | Sigma-Aldrich | -- | |
| RU486 | Sigma-Aldrich | M8046 | |
| ICI 182780 | Sigma-Aldrich | V900926 | |
| PPT | Sigma-Aldrich | H6036 | |
| DPN | Sigma-Aldrich | H5915 | |
| 延迟着床激活 | 17β-雌二醇 | Sigma-Aldrich | 850454 |
| 细胞分离 | HBSS平衡盐溶液 | Sigma-Aldrich | H4891 |
| 胰蛋白酶 | Amresco | 0458 | |
| 分散酶II | Roche Applied Science | 0494207801 | |
| 胶原酶I | Invitrogen | 17100-017 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Sigma-Aldrich | D2906 |
| 活性炭处理胎牛血清 | Biological Industries | 040011A | |
| 药物处理 | 花生四烯酸 | Sigma-Aldrich | 181198 |
| 伊洛前列素 | Med Chem Express | ZK36374 | |
| GW501516 | Cayman Chemical Company | -- | |
| NS398 | Med Chem Express | -- | |
| GSK0660 | Selleck | -- | |
| 上皮细胞处理 | 乳酸 | Aladdin | L118493 |
| 共培养处理 | AZD3965 | Med Chem Express | HY12750 |
| siRNA转染 | 脂质体转染试剂2000 | Invitrogen | 11668019 |
| 原位杂交 | pGEM-T质粒 | Promega Corporation | A1360 |
| 左旋咪唑 | Sigma-Aldrich | 1359302 | |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 | Sigma-Aldrich | B6274 | |
| 氮蓝四唑 | Sigma-Aldrich | N5514 | |
| 甲基绿 | Sigma-Aldrich | M8884 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Takara | 9109 |
| HiScript II Q RT SuperMix反转录试剂盒 | Vazyme | R222-01-AB | |
| SYBR Premix Ex Taq试剂盒 | Vazyme | Q311-02-AA | |
| 免疫荧光 | 抗S100A6抗体 | Abcam | ab181975 |
| 抗RAGE抗体 | Abmart | ab216329 | |
| 山羊抗兔Alexa 488偶联抗体 | Invitrogen | G21234 | |
| 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| 抗淬灭封片剂 | Sino Biological | -- | |
| 徕卡激光共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| PVDF膜 | Merck KGaA | -- | |
| 脱脂奶粉 | BBI Life Sciences | -- | |
| 抗S100A6抗体 | Cell Signaling Technology | 1316S | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2144S | |
| 抗RAGE抗体 | Abamrt | TA5309S | |
| 抗磷酸化EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 3777s | |
| 抗EGFR抗体 | Abcam | ab52894 | |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370s | |
| 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 抗磷酸化cPLA2抗体 | Cell Signaling Technology | 2831s | |
| 抗PPARδ抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc74517 | |
| 抗COX2抗体 | Cell Signaling Technology | 4842s | |
| 抗PGIS抗体 | Abcam | ab23668 | |
| 抗SNAIL抗体 | Cell Signaling Technology | 3879s | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3195s | |
| 抗ZO1抗体 | Abcam | ab221547 | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Invitrogen | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Millipore | -- | |
| 天能5200成像系统 | Tanon | -- | |
| ELISA | E-EL-0051c检测试剂盒 | Elabscience | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物处理 | 小鼠品系CD1,6-8周龄;妊娠或假孕建立;芝加哥蓝染料注射鉴定着床点 阅读提示:参见Materials and Methods中的Animal treatment |
| 细胞分离和培养 | 第4天假孕小鼠子宫分离;酶消化条件;培养基成分 阅读提示:参见Materials and Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells和Isolation and culture of mouse endometrial epithelial cells |
| 乳酸处理 | 乳酸浓度20 mM,处理时间3小时 阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of mouse endometrial epithelial cells |
| 体外蜕膜化诱导 | 基质细胞用孕酮和雌二醇浓度(原文为1 μM和10 M,疑为笔误) 阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells |
| 抑制剂处理 | 各抑制剂浓度:U0126、FPS-ZM1、EGFR抑制剂、AA、Iloprost、GW501516、NS398、GSK0660、AZD3965 阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells和Coculture of mouse endometrial epithelial and stromal cells |