囊胚来源的乳酸可能通过刺激子宫上皮花生四烯酸分泌来调节小鼠蜕膜化中的S100A6表达和功能

Blastocyst-Derived Lactic Acid May Regulate S100A6 Expression and Function in Mouse Decidualization via Stimulation of Uterine Epithelial Arachidonic Acid Secretion.

作者信息Meng-Yuan Li, Ying Wang, Ying Wu, Xu-Yu Zhao, Zhen-Shan Yang, Bo Li, Si-Ting Chen, Yu-Ying He, Zeng-Ming Yang
PMID38334598
期刊Cells
发布时间2024-01-23
DOI10.3390/cells13030206

实验完整度

包含体内小鼠模型(妊娠、假孕、延迟着床、卵巢切除)和体外细胞实验(分离培养、敲低/过表达、抑制剂),并进行功能验证和机制验证。

主要模型

小鼠子宫内膜上皮细胞和基质细胞原代培养 小鼠妊娠/假孕模型 小鼠延迟着床和激活模型 卵巢切除小鼠模型

重点核对

小鼠品系CD1,6-8周龄 妊娠第1-8天,假孕第4天 乳酸处理浓度20 mM,处理3小时 AA处理浓度20 μM,处理3小时 孕酮剂量1 mg/只,皮下注射 雌激素剂量100 ng/只(或25 ng/只激活延迟着床)

摘要

(1) 背景:炎症反应与胚胎着床、蜕膜化、妊娠维持和分娩有关。胚胎着床和蜕膜化对啮齿动物和灵长类动物的成功妊娠都至关重要。S100A6参与炎症、肿瘤发展、凋亡和钙稳态。S100A6在小鼠蜕膜中强烈表达,但S100A6如何调节着床和蜕膜化的潜在机制尚不清楚。(2) 方法:从第4天假孕小鼠子宫中分离小鼠子宫内膜基质细胞和上皮细胞。免疫荧光和Western blotting用于分析蛋白质的表达和定位。通过Western blotting和定量聚合酶链反应在体外验证分子机制。(3) 结果:在妊娠第4至8天,S100A6在小鼠腔下基质细胞中特异性表达。囊胚来源的乳酸通过激活腔上皮p-cPLA2诱导AA分泌。上皮AA通过COX2/PGI2/PPAR δ通路诱导基质S100A6表达。孕酮通过孕酮受体(PR)调节S100A6表达。S100A6/RAGE信号通路可在体外通过EGFR/ERK1/2调节蜕膜化。(4) 结论:S100A6作为一种炎症介质,对小鼠着床和蜕膜化很重要。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
S100A6在小鼠着床和蜕膜化中的表达调控机制及其功能是什么?
核心机制
囊胚来源的乳酸通过激活腔上皮cPLA2促进AA分泌,AA通过COX2/PGI2/PPAR δ通路诱导基质细胞S100A6表达;S100A6通过RAGE/EGFR/ERK1/2通路调节蜕膜化。
主要证据
在体实验显示S100A6在着床点腔下基质细胞高表达;体外实验用乳酸、AA、Iloprost、GW501516、抑制剂等处理细胞,以及S100A6敲低/过表达结合通路抑制剂,证实了该机制。
研究意义
S100A6作为炎症介质,在小鼠着床和蜕膜化中发挥重要作用,为理解炎症反应在妊娠建立中的作用提供新见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

S100A6表达模式分析

确定S100A6在早期妊娠小鼠子宫中的表达位置和时间。

通过原位杂交、免疫荧光、RT-qPCR和Western blot检测妊娠第1-8天子宫中S100A6的表达。

2

囊胚对S100A6表达的诱导验证

验证活性囊胚是否诱导S100A6表达。

比较假孕第4天与妊娠第4天、延迟着床与激活着床、着床点与非着床点S100A6表达。

3

乳酸调节S100A6的机制研究

探讨囊胚来源乳酸是否通过AA/COX2/PGI2/PPARδ通路诱导S100A6表达。

用乳酸处理上皮细胞检测p-cPLA2和AA分泌;用AA、Iloprost、GW501516及抑制剂处理基质细胞检测S100A6及相关蛋白;共培养实验验证细胞间通讯。

4

S100A6对体外蜕膜化的功能验证

验证S100A6是否影响小鼠体外蜕膜化。

通过siRNA敲低和过表达S100A6,检测蜕膜化标志物Prl8a2及上皮间质转化相关蛋白。

5

S100A6下游机制验证

验证S100A6是否通过RAGE/EGFR/ERK1/2通路调节蜕膜化。

在S100A6过表达细胞中,使用RAGE抑制剂FPS-ZM1、EGFR抑制剂和U0126处理,检测Prl8a2及通路蛋白磷酸化水平。

6

孕酮和雌激素对S100A6的调控研究

验证孕酮和雌激素是否通过其受体调节S100A6表达。

在卵巢切除小鼠中分别注射孕酮、雌激素及相应受体拮抗剂或激动剂,检测S100A6表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
芝加哥蓝染料Sigma-AldrichC8679
孕酮Sigma-AldrichE1024
17β-雌二醇Sigma-AldrichE8875
芝麻油Sigma-Aldrich--
RU486Sigma-AldrichM8046
ICI 182780Sigma-AldrichV900926
PPTSigma-AldrichH6036
DPNSigma-AldrichH5915
17β-雌二醇Sigma-Aldrich850454
HBSS平衡盐溶液Sigma-AldrichH4891
胰蛋白酶Amresco0458
分散酶IIRoche Applied Science0494207801
胶原酶IInvitrogen17100-017
DMEM/F12培养基Sigma-AldrichD2906
活性炭处理胎牛血清Biological Industries040011A
花生四烯酸Sigma-Aldrich181198
伊洛前列素Med Chem ExpressZK36374
GW501516Cayman Chemical Company--
NS398Med Chem Express--
GSK0660Selleck--
乳酸AladdinL118493
AZD3965Med Chem ExpressHY12750
脂质体转染试剂2000Invitrogen11668019
pGEM-T质粒Promega CorporationA1360
左旋咪唑Sigma-Aldrich1359302
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸Sigma-AldrichB6274
氮蓝四唑Sigma-AldrichN5514
甲基绿Sigma-AldrichM8884
TRIzol试剂Takara9109
HiScript II Q RT SuperMix反转录试剂盒VazymeR222-01-AB
SYBR Premix Ex Taq试剂盒VazymeQ311-02-AA
抗S100A6抗体Abcamab181975
抗RAGE抗体Abmartab216329
山羊抗兔Alexa 488偶联抗体InvitrogenG21234
碘化丙啶Sigma-AldrichP4170
抗淬灭封片剂Sino Biological--
徕卡激光共聚焦显微镜Leica--
BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific--
PVDF膜Merck KGaA--
脱脂奶粉BBI Life Sciences--
抗S100A6抗体Cell Signaling Technology1316S
抗α-微管蛋白抗体Cell Signaling Technology2144S
抗RAGE抗体AbamrtTA5309S
抗磷酸化EGFR抗体Cell Signaling Technology3777s
抗EGFR抗体Abcamab52894
抗磷酸化ERK1/2抗体Cell Signaling Technology4370s
抗ERK1/2抗体Cell Signaling Technology9102
抗磷酸化cPLA2抗体Cell Signaling Technology2831s
抗PPARδ抗体Santa Cruz Biotechnologysc74517
抗COX2抗体Cell Signaling Technology4842s
抗PGIS抗体Abcamab23668
抗SNAIL抗体Cell Signaling Technology3879s
抗E-钙黏蛋白抗体Cell Signaling Technology3195s
抗ZO1抗体Abcamab221547
辣根过氧化物酶标记二抗Invitrogen--
ECL化学发光试剂盒Millipore--
天能5200成像系统Tanon--
E-EL-0051c检测试剂盒Elabscience--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物处理
小鼠品系CD1,6-8周龄;妊娠或假孕建立;芝加哥蓝染料注射鉴定着床点
阅读提示:参见Materials and Methods中的Animal treatment
细胞分离和培养
第4天假孕小鼠子宫分离;酶消化条件;培养基成分
阅读提示:参见Materials and Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells和Isolation and culture of mouse endometrial epithelial cells
乳酸处理
乳酸浓度20 mM,处理时间3小时
阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of mouse endometrial epithelial cells
体外蜕膜化诱导
基质细胞用孕酮和雌二醇浓度(原文为1 μM和10 M,疑为笔误)
阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells
抑制剂处理
各抑制剂浓度:U0126、FPS-ZM1、EGFR抑制剂、AA、Iloprost、GW501516、NS398、GSK0660、AZD3965
阅读提示:参见Methods中的Isolation and culture of endometrial stromal cells和Coculture of mouse endometrial epithelial and stromal cells