微生物组和宏蛋白质组分析
比较瘢痕疙瘩与正常皮肤组织的细菌组成差异，并鉴定差异丰度细菌。
对瘢痕疙瘩和正常皮肤组织进行16S rRNA基因测序和宏蛋白质组学分析，鉴定细菌种类和丰度差异。
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多组学分析揭示与瘢痕疙瘩相关的细菌和过氧化氢酶
Multi-omics analyses reveal bacteria and catalase associated with keloid disease.
实验完整度
高包含微生物组、宏蛋白质组、代谢组、单细胞转录组及CDX小鼠模型等多个独立证据层级，并进行CAT敲低/过表达功能验证和体内验证。
主要模型
人瘢痕疙瘩组织样本 人正常皮肤组织样本 瘢痕疙瘩原代成纤维细胞 BALB/c雌性裸鼠CDX模型
重点核对
样本来源：瘢痕疙瘩组织和正常皮肤组织的采集部位及患者特征 分组：瘢痕疙瘩组与正常对照组，以及CAT敲低/过表达组与相应对照组 细菌处理：丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌与成纤维细胞共培养的MOI（10:1）及浓度（1.5×10^8 CFU/mL） 动物模型：BALB/c雌性裸鼠，注射细胞浓度1×10^7 cells/mL，体积0.1 mL，观察1个月 检测指标：成纤维细胞增殖（CCK8）、迁移和侵袭、H2O2和ROS水平、CAT活性、胶原蛋白表达、NF-κB和AKT信号通路
摘要
背景：瘢痕疙瘩的病理尤其是细菌在其中的作用尚不清楚。方法：本研究采用多组学分析，包括微生物组、宏蛋白质组、代谢组、单细胞转录组和细胞源性异种移植（CDX）小鼠模型，探讨细菌在瘢痕疙瘩疾病中的作用。发现：我们发现瘢痕疙瘩与健康皮肤之间的细菌类型存在显著差异。16S rRNA测序和宏蛋白质组学显示，与相邻健康皮肤相比，瘢痕疙瘩中存在更多的过氧化氢酶（CAT）阴性细菌，如梭菌属和罗斯氏菌属。此外，蛋白质质谱显示CAT是差异表达蛋白（DEPs）之一。CAT的过表达抑制了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖、迁移和侵袭，而CAT敲低时这些特征相反。此外，CDX模型显示，丁酸梭菌促进患者瘢痕疙瘩成纤维细胞在BALB/c雌性裸鼠中的生长，而CAT阳性细菌枯草芽孢杆菌抑制其生长。单细胞RNA测序证实，瘢痕疙瘩的间充质样成纤维细胞中氧化应激上调，CAT下调。解释：总之，我们的发现表明细菌和CAT参与瘢痕疙瘩疾病。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细菌在瘢痕疙瘩中的作用以及过氧化氢酶（CAT）在瘢痕疙瘩病理中的功能。
- 核心机制
- CAT阴性细菌（如丁酸梭菌）可能通过增加H2O2和ROS促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长，而CAT通过清除ROS抑制细胞增殖、迁移和侵袭，涉及NF-κB和AKT信号通路。
- 主要证据
- 16S rRNA测序和宏蛋白质组显示瘢痕疙瘩中CAT阴性细菌富集；CAT过表达抑制成纤维细胞功能，敲低促进；CDX模型显示丁酸梭菌促进肿瘤生长，枯草芽孢杆菌抑制；单细胞RNA测序显示瘢痕疙瘩间充质样成纤维细胞氧化应激上调、CAT下调。
- 研究意义
- 研究表明细菌和CAT可能作为瘢痕疙瘩治疗的新靶点，为开发新的治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细菌分离和鉴定
从瘢痕疙瘩组织中分离并鉴定具体细菌种类。
采用皮升级微流控培养技术分离细菌，并通过全自动微生物核酸分析系统鉴定种类。
细菌与成纤维细胞共培养功能实验
研究特定细菌（丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌）对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和氧化应激的影响。
将丁酸梭菌和枯草芽孢杆菌与瘢痕疙瘩原代成纤维细胞共培养，检测细胞增殖、H2O2和ROS水平。
CAT表达和功能验证
验证CAT在瘢痕疙瘩组织和成纤维细胞中的表达水平，并研究其对细胞功能的影响。
通过IHC、qRT-PCR、Western blot、免疫荧光检测CAT表达；通过慢病毒感染敲低或过表达CAT，检测细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期。
CDX动物模型验证
在体内验证CAT和特定细菌对瘢痕疙瘩生长的影响。
将过表达或敲低CAT的成纤维细胞，以及混合丁酸梭菌或枯草芽孢杆菌的成纤维细胞皮下注射到裸鼠体内，观察肿块生长情况。
单细胞RNA测序分析
分析瘢痕疙瘩和正常皮肤组织中细胞异质性和氧化应激相关基因表达。
对6例瘢痕疙瘩和6例正常皮肤组织进行单细胞转录组测序，鉴定细胞亚群并比较基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA测序 | TruSeq® DNA PCR-Free 样品制备试剂盒 | Illumina | -- |
| Qubit 2.0 荧光计 | Thermo Scientific | -- | |
| 代谢组学 | Thermo Q Exactive Plus 质谱仪 | Thermo | -- |
| Thermo Ultimate 3000 液相色谱 | Thermo | -- | |
| 宏蛋白质组学 | Orbitrap Exploris 480 质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| 单细胞测序 | GEXSCOPE™ 组织解离液 | Singleron | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 细菌分离培养 | 哥伦比亚血琼脂培养基 | Thermo Fisher Scientific | PB0123A |
| 巧克力琼脂培养基 | Thermo Fisher Scientific | PB8124A | |
| 中国蓝琼脂培养基 | Sigma | 1023480500 | |
| 哥伦比亚琼脂 | Thermo Fisher Scientific | CM331 | |
| GENbag厌氧袋 | Marcel Mérieux | 45534 | |
| 细菌鉴定 | 全自动微生物核酸分析系统 | Antu Biology | -- |
| 细菌共培养 | AnaeroPack™ 2.5L 矩形培养罐 | -- | -- |
| AnaeroPack-Anaero 5% 产气袋 | -- | C-04 | |
| 脂多糖 | AbMole | M9524 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Sigma-Aldrich | R0278 |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 过氧化氢酶抗体 | Proteintech | 21260-1-AP | |
| III型胶原抗体 | Proteintech | 22734-1-AP | |
| NF-κB P65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| AKT抗体 | Proteintech | 10176-2-AP | |
| 磷酸化NF-κB p65 (Ser468)重组抗体 | Proteintech | 82335-1-RR | |
| 磷酸化AKT (Ser473)单克隆抗体 | Proteintech | 66444-1-Ig | |
| FISH | 蛋白酶K | Servicebio | G1205 |
| 2× SSC缓冲液 | Servicebio | G3016-4 | |
| DAPI染色液 | Servicebio | G1012 | |
| EUB338探针 | -- | -- | |
| 奥林巴斯共聚焦显微镜FV1000MPE | Olympus | -- | |
| 正置荧光显微镜NIKON DS-U3 | NIKON | DS-U3 | |
| 全景切片扫描仪PANNORAMIC DESK/MIDI/250/1000 | 3DHISTECH | -- | |
| CaseViewer2.4软件 | 3DHISTECH | -- | |
| Image-Pro Plus 6.0软件 | Media Cybernetics | -- | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher | -- |
| Nanodrop 8000 分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SuperScript III Platinum一步法qRT-PCR试剂盒 | Thermo Fisher | -- | |
| CFX96实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | BD Accuri C6 Plus流式细胞仪 | BD | -- |
| CCK8检测 | CCK8检测试剂 | Beyotime | C0037 |
| 过氧化氢酶活性检测 | 过氧化氢酶检测试剂盒 | Beyotime | S0051 |
| H2O2检测 | 过氧化氢检测试剂盒 | Beyotime | S0038 |
| ROS检测 | 活性氧荧光检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K138-F |
| 动物实验 | Zoletil 50麻醉剂 | Virbac | -- |
| 细菌培养 | 脑心浸液肉汤 | -- | -- |
| 微流控芯片制作 | 聚二甲基硅氧烷 | -- | -- |
| Aquapel疏水剂 | PGW Auto Glass | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 瘢痕疙瘩组织和正常组织的采集部位、大小、患者特征（性别、年龄）以及样本数量 阅读提示：Methods - Clinical samples, Table 1 |
| 16S rRNA测序 | 引物序列（341F和806R）、测序平台（Illumina NovaSeq）、OTU聚类方法（UPARSE，97%一致性） 阅读提示：Methods - Microbiome |
| 细菌分离培养 | 培养条件（有氧/厌氧）、培养基类型和培养时间 阅读提示：Methods - Isolation and culture of bacteria via microfluidic cultivation |
| 细菌与成纤维细胞共培养 | MOI（10:1）、细菌浓度（1.5×10^8 CFU/mL）、细胞接种量（5000细胞/孔）、检测时间点（6h, 12h, 18h） 阅读提示：Methods - Infection of keloid fibroblasts with target bacteria |
| CAT敲低和过表达 | 靶序列（KD: CGGAGATTCAACACTGCCAAT; 过表达载体GV492）、慢病毒滴度、感染条件、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL） 阅读提示：Methods - CAT knockdown and overexpression in keloid fibroblasts |
| CDX模型 | 小鼠品系（BALB/c雌性裸鼠）、年龄（4周）、每组数量（n=6）、细胞注射浓度（1×10^7 cells/mL）、体积（0.1 mL）、细菌浓度（1.5×10^8 CFU/mL）、观察时间（1个月） 阅读提示：Methods - Mouse xenograft |
| 单细胞RNA测序 | 样本数量（6个瘢痕疙瘩，6个正常）、细胞数（215,795）、组织解离方法、测序平台（Illumina HiSeq X） 阅读提示：Methods - Single-cell sequencing |