生物信息学分析筛选关键基因
鉴定AS相关的关键基因和信号通路
从GEO数据库下载AS相关转录组芯片GSE25101和GSE13782，利用R软件limma包筛选差异表达基因，并与GeneCards数据库中的AS相关基因取交集，进行GO和KEGG富集分析。
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AMPK/YAP/NLRP3信号通路影响强直性脊柱炎发生发展的分子机制
Molecular mechanisms of AMPK/YAP/NLRP3 signaling pathway affecting the occurrence and development of ankylosing spondylitis.
实验完整度
高包含生物信息学分析、临床样本检测、体外细胞实验（Western blot、ELISA、免疫共沉淀、敲低和药物处理）以及体内动物模型验证等多个独立证据层级，并有明确的功能与机制验证。
主要模型
AS患者外周血单个核细胞 健康对照外周血单个核细胞 HEK293T细胞 人滑膜成纤维细胞（HSF） 蛋白聚糖诱导的BALB/c小鼠AS模型
重点核对
AS患者与健康对照样本量各30例，性别年龄匹配 AMPK抑制剂BAY-3827和激活剂二甲双胍的处理浓度及时间（10 μM/48 h，5 mM/48 h） MG132浓度梯度（0.5、1.0、2.0 μmol/L）用于泛素化检测 蛋白聚糖诱导小鼠AS模型的注射时间（第0、3、6周）和剂量（200 μL） 慢病毒注射剂量（10 μg/只）及给药途径（尾静脉）
摘要
背景：利用公共数据库分析、体外和体内实验，研究AMPK/YAP/NLRP3信号通路在强直性脊柱炎（AS）发展中的作用。方法：检索AS数据集，在R中进行差异基因表达分析，进行功能富集分析，收集30例AS患者和30例正常对照样本，并构建小鼠模型。采用ELISA、IP和敲低实验检测表达变化。结果：NLRP3被确定为重要的AS相关基因。AS患者中Caspase-1、IL-1β、IL-17A、IL-18、IL-23、YAP和NLRP3表达上调。过表达AMPK抑制了YAP对NLRP3泛素化的阻滞，减少了成纤维细胞的骨化。抑制AMPK加重了AS小鼠的症状。结论：AMPK可能抑制YAP表达，导致NLRP3炎症小体抑制和AS缓解。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s13018-023-04200-x获取。关键词：强直性脊柱炎、AMPK、磷酸化激活、YAP、NLRP3、泛素化降解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AMPK/YAP/NLRP3信号通路在强直性脊柱炎发生发展中的作用及其分子机制。
- 核心机制
- AMPK可抑制YAP表达，从而解除YAP对NLRP3 K27泛素化的抑制作用，促进NLRP3降解，抑制NLRP3炎症小体活化，减轻炎症反应和AS症状。
- 主要证据
- 通过GEO数据库分析、AS患者外周血样本检测、细胞实验（过表达AMPK、敲低YAP/NLRP3）以及AS小鼠模型验证，发现AMPK激活或YAP/NLRP3敲低可降低炎症因子水平和减轻脊柱破坏。
- 研究意义
- 研究加深了对AS病理机制的理解，为早期诊断和疾病进展预测提供帮助，并为靶向AMPK的药物开发提供理论基础，有望为AS患者带来新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
临床样本中炎症因子和信号通路蛋白表达检测
验证AS患者外周血中炎症因子水平和AMPK/YAP/NLRP3信号通路的变化
收集AS患者和健康对照外周血，分离血清和PBMC，采用ELISA检测炎症因子水平，Western blot检测蛋白表达，并检测AMP/ATP比值、线粒体复合物活性和线粒体ROS。
细胞实验验证AMPK对NLRP3泛素化的调控
探究AMPK、YAP和NLRP3之间的调控关系
在HEK293T细胞中共转染Myc-NLRP3、HA-Ub、GFP-YAP、Flag-AMPK等质粒，加入MG132抑制蛋白酶体，通过免疫共沉淀检测NLRP3的泛素化水平。
细胞实验验证AMPK对炎症因子分泌和成纤维细胞骨化的影响
检测AMPK及其下游YAP/NLRP3在单核细胞炎症反应和成纤维细胞骨化中的作用
用shRNA敲低YAP或NLRP3，或用BAY-3827、二甲双胍处理AS患者单核细胞，收集条件培养基与人滑膜成纤维细胞共培养，检测炎症因子分泌和成纤维细胞骨化（ALP活性、ALP染色、茜素红染色）。
动物模型验证AMPK/YAP/NLRP3通路在AS中的作用
在体内验证AMPK/YAP/NLRP3通路对AS症状的影响
构建蛋白聚糖诱导的BALB/c小鼠AS模型，通过尾静脉注射sh-NLRP3、BAY-3827、二甲双胍等，检测炎症因子水平、CT影像和组织学变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 生物信息学分析 | GSE25101数据集 | -- | -- |
| GSE13782数据集 | -- | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | 10100147 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 10378016 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Yisheng Biotech | 40127ES60 | |
| ELISA | Caspase-1 ELISA试剂盒（人） | Thermo Fisher | EH70RB |
| Caspase-1 ELISA试剂盒（小鼠） | MSK | kt21346 | |
| IL-1β ELISA试剂盒（人） | MSK | kt98060 | |
| IL-1β ELISA试剂盒（小鼠） | MSK | kt21178 | |
| IL-17A ELISA试剂盒（人） | MSK | kt99222 | |
| IL-17A ELISA试剂盒（小鼠） | MSK | kt21287 | |
| IL-18 ELISA试剂盒（人） | MSK | kt98065 | |
| IL-18 ELISA试剂盒（小鼠） | MSK | kt21183 | |
| IL-23 ELISA试剂盒（人） | MSK | kt98055 | |
| IL-23 ELISA试剂盒（小鼠） | MSK | kt21102 | |
| RT-qPCR | Trizol试剂 | Invitrogen | 10296010 |
| PrimeScript™ RT-qPCR试剂盒 | TaKaRa | RR086A | |
| SYBR Premix Ex TaqTM | TaKaRa | DRR820A | |
| LightCycler 480系统 | Roche Diagnostics | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Dr. De | AR0108 |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Dr. De | AR1189 | |
| p-AMPK抗体 | CST | 50081 | |
| AMPK抗体 | CST | 5831 | |
| p-YAP抗体 | CST | 13008 | |
| YAP抗体 | CST | 12395 | |
| NLRP3抗体 | CST | 15101 | |
| GAPDH抗体 | Sigma | G9545 | |
| Myc标签抗体 | CST | 2272 | |
| HA标签抗体 | CST | 2367 | |
| Flag标签抗体 | Sigma | MA1-91878 | |
| 抗鼠HRP二抗 | CST | 7076 | |
| 抗兔HRP二抗 | CST | 7074 | |
| ECL工作液 | Beijing Aomijia De Medical Technology Co., Ltd. | Omt-01 | |
| Image J软件 | -- | -- | |
| 检测ATP/AMP | ATP检测试剂盒 | Beijing Solabao | BC0304 |
| AMP含量检测试剂盒 | Beijing Solabao | BC1024 | |
| 高效液相色谱仪 | SCIEX | SCIEX | |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色线粒体超氧化物指示剂 | Thermo Fisher | M36008 |
| 激光共聚焦显微镜 | Leica | STELLARIS | |
| 线粒体呼吸链复合物检测 | 线粒体呼吸链复合物I比色法试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-BC-K149-M |
| 线粒体呼吸链复合物II比色法试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-BC-K150-M | |
| 线粒体呼吸链复合物III比色法试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-BC-K151-M | |
| 线粒体呼吸链复合物IV比色法试剂盒 | Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd. | E-BC-K152-M | |
| 泛素化检测 | MG132 | MCE | Y-13259 |
| Protein A/G琼脂糖珠 | Abcam | ab193262 | |
| 质粒转染 | Myc-NLRP3质粒 | Shanghai Bioengineering | -- |
| HA-Ub质粒 | Shanghai Bioengineering | -- | |
| GFP-YAP质粒 | Shanghai Bioengineering | -- | |
| Flag-AMPK质粒 | Shanghai Bioengineering | -- | |
| 细胞分组与感染 | 人NLRP3-shRNA | Sigma-Aldrich | -- |
| 人YAP-shRNA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠NLRP3-shRNA | Sigma-Aldrich | -- | |
| 小鼠YAP-shRNA | Sigma-Aldrich | -- | |
| sh-NC | Sigma-Aldrich | -- | |
| 聚凝胺 | Merck | TR-1003 | |
| 嘌呤霉素 | Gibco | A1113803 | |
| 药物处理 | BAY-3827 | Selleck | S9833 |
| ASC斑点检测 | 脂多糖 | Sigma-Aldrich | SMB00610 |
| 尼日利亚霉素 | Genewiz | S25116 | |
| ALP活性测定 | ALP定量检测试剂盒 | BiyunTian | P0321S |
| ALP染色 | 碱性磷酸酶比色试剂盒 | Puhe BioTech | CTCC-JD002 |
| 茜素红染色 | 番红O染色试剂盒 | Shanghai Yajie Biotechnology | C01383 |
| 动物实验 | 二甲基双十八烷基溴化铵 | -- | -- |
| 蛋白聚糖 | Sigma-Aldrich | P5864-10MG | |
| micro-CT | 台式锥形束微型CT扫描仪 | Guangzhou Light Instrument Co., Ltd. | LASER6000 |
| NRecon软件 | Bruker microCT | -- | |
| 免疫组织化学 | Vimentin抗体 | CST | 46173 |
| 抗兔HRP二抗 | CST | 8114 | |
| DAB显色试剂 | Abcam | ab64238 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本收集 | AS患者和健康对照的纳入与排除标准，样本量（各30例），年龄和性别匹配情况 阅读提示：Materials and methods: Clinical sample |
| 细胞培养 | 细胞系来源，培养基成分（RPMI 1640+10% FBS+1%青霉素-链霉素），培养条件（37°C，5% CO2），传代方法 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 药物处理 | BAY-3827浓度（10 μM）和二甲双胍浓度（5 mM），处理时间（48小时） 阅读提示：Materials and methods: Drug treatment doses for cells |
| 泛素化检测 | 质粒转染组合（Myc-NLRP3、HA-Ub、GFP-YAP、Flag-AMPK），MG132浓度梯度（0.5、1.0、2.0 μmol/L），免疫沉淀和免疫印迹抗体 阅读提示：Materials and methods: Ubiquitin-mediated immunoprecipitation |
| 动物模型构建 | 小鼠品系（BALB/c），周龄（24-26周），性别（雄性），免疫佐剂和蛋白聚糖的剂量及注射时间（第0、3、6周），安乐死时间（18周后） 阅读提示：Materials and methods: Construction of AS mouse model |
| 动物实验给药 | 慢病毒注射剂量（10 μg/只），BAY-3827剂量（0.02 mg/kg），二甲双胍剂量（5 mg/kg），注射途径（尾静脉），注射时间（建模成功后7天开始，连续一周） 阅读提示：Materials and methods: Construction of AS mouse model |