建立饮食诱导的HCC小鼠模型
通过对照饮食或胆碱缺乏饮食喂食小鼠，诱导NAFLD和HCC。
从2月龄开始，雄性和雌性WT、Ripk3−/−和Mlkl−/−小鼠分别喂食NC、CD-LFD或CD-HFD，持续6个月。
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缺乏Ripk3或Mlkl可降低肝细胞癌的发生率，且与肝纤维化无关
Absence of Either Ripk3 or Mlkl Reduces Incidence of Hepatocellular Carcinoma Independent of Liver Fibrosis.
实验完整度
高包含动物模型（Ripk3−/−、Mlkl−/−小鼠）、多种检测方法（Western blot、qRT-PCR、流式、IHC、RNA-seq）及功能验证（肿瘤结节计数）和机制验证（信号通路分析）。
主要模型
野生型（WT）小鼠 Ripk3−/−小鼠 Mlkl−/−小鼠
重点核对
小鼠性别：雄性 vs 雌性 饮食类型：对照饮食（NC）、胆碱缺乏低脂饮食（CD-LFD）、胆碱缺乏高脂饮食（CD-HFD） 喂食周期：6个月 基因型：WT、Ripk3−/−、Mlkl−/− 肿瘤评估：肝脏结节数目和大小
摘要
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是导致肝细胞癌（HCC）的病因之一，慢性炎症被认为是HCC的介质之一。由于坏死性凋亡是一种诱导炎症的细胞死亡途径，我们在饮食诱导的HCC小鼠模型中测试了坏死性凋亡诱导的炎症是否促进NAFLD向HCC的进展。雄性和雌性野生型（WT）小鼠以及坏死性凋亡被阻断的小鼠模型（Ripk3−/−或Mlkl−/−小鼠）分别喂食对照饮食、胆碱缺乏低脂饮食或胆碱缺乏高脂饮食。阻断坏死性凋亡可减少雄性小鼠的炎症标志物[促炎细胞因子（TNFα、IL6和IL1β）、F4/80+巨噬细胞、CCR2+浸润单核细胞]、炎症相关致癌途径（JNK、PD-L1/PD-1、β-catenin）和HCC。我们证明，肝脏坏死性凋亡促进肝脏巨噬细胞的募集和活化，导致慢性炎症，进而触发致癌途径，促进雄性小鼠NAFLD向HCC的进展。而在雌性小鼠中，阻断坏死性凋亡可减少HCC，但与炎症无关。我们的数据显示，WT小鼠在炎症、纤维化和HCC的发展中存在性别特异性差异。然而，阻断坏死性凋亡在雄性和雌性中均减少了HCC，而没有改变肝纤维化。因此，我们的研究表明，坏死性凋亡是NAFLD介导的HCC的一个有效治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 坏死性凋亡诱导的炎症是否促进NAFLD向HCC的进展，以及性别差异的影响。
- 核心机制
- 肝脏坏死性凋亡促进巨噬细胞募集和活化，导致慢性炎症，进而激活JNK、PD-L1/PD-1、β-catenin等致癌途径，促进HCC发展。
- 主要证据
- 雄性WT小鼠喂食CD-HFD后，坏死性凋亡标志物（MLKL寡聚体、p-MLKL）和炎症标志物升高，而Ripk3−/−或Mlkl−/−小鼠中这些标志物降低，肿瘤结节数和大小也显著减少。
- 研究意义
- 坏死性凋亡是NAFLD介导的HCC的有效治疗靶点，研究强调在治疗策略开发中考虑性别差异。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估坏死性凋亡标志物
验证CD-HFD是否诱导肝脏坏死性凋亡。
通过Western blot检测MLKL寡聚体、MLKL、RIPK3、p-MLKL、p-RIPK3，通过IHC检测p-MLKL，ELISA检测血浆HMGB1。
比较不同基因型小鼠的HCC发展
判断敲除Ripk3或Mlkl是否影响HCC的发生。
观察肝脏结节数目和大小，IHC检测Glypican-3和Ki-67，ELISA检测血清AFP。
分析炎症和免疫细胞浸润
检测坏死性凋亡对肝脏炎症的影响。
通过qRT-PCR检测促炎细胞因子（IL6、TNFα、IL1β、CCL2），ELISA检测血浆IL6、TNFα、CCL2，流式分析F4/80+巨噬细胞和CCR2+单核细胞。
评估纤维化程度
检测坏死性凋亡是否影响肝纤维化。
通过PSR染色、羟脯氨酸（OHP）含量、qRT-PCR检测Col3α1、Acta2、Col1α1、TGFβ，Western blot检测desmin和α-SMA。
检测致癌信号通路
探索坏死性凋亡影响HCC的机制。
通过Western blot检测JNK、β-catenin、cyclin D1、PD-L1的磷酸化或表达水平，qRT-PCR检测c-Myc、EpCAM、PD-L1、PD-1。
转录组分析
揭示坏死性凋亡对肝脏转录组的影响。
对雄性小鼠肝脏进行RNA-seq，分析差异表达基因和通路，并通过qRT-PCR验证部分基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饮食 | 胆碱缺乏高脂饮食（A06071302i） | Research Diets | A06071302i |
| 胆碱缺乏低脂饮食（A06071324i） | Research Diets | A06071324i | |
| 正常对照饮食（5053 Pico Lab） | Purina Mills | -- | |
| Western blot | MLKL抗体（#MABC604） | Millipore Sigma | MABC604 |
| α-SMA抗体（#A5228） | Millipore Sigma | A5228 | |
| RIPK3抗体（#NBP1-77299） | Novus Biologicals | NBP1-77299 | |
| β-微管蛋白抗体（#T5201） | Sigma-Aldrich | T5201 | |
| Desmin抗体（#PA5-16705） | Invitrogen | PA5-16705 | |
| p-SAPK/JNK抗体（#4668P） | Cell Signaling Technology | 4668P | |
| SAPK/JNK抗体（#9252） | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| p-p38 MAPK抗体（#9211S） | Cell Signaling Technology | 9211S | |
| p38 MAPK抗体（#9212） | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| p-p44/42 MAPK抗体（#9101S） | Cell Signaling Technology | 9101S | |
| p44/42 MAPK抗体（#4695S） | Cell Signaling Technology | 4695S | |
| β-连环蛋白抗体（#8480） | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体（#2978） | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| p-AKT抗体（#4056） | Cell Signaling Technology | 4056 | |
| AKT2抗体（#3063S） | Cell Signaling Technology | 3063S | |
| p-S6核糖体蛋白抗体（#4857） | Cell Signaling Technology | 4857 | |
| S6核糖体蛋白抗体（#2217） | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| Cleaved caspase-3抗体（#9664） | Cell Signaling Technology | 9664 | |
| Caspase-3抗体（#9662） | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| p62抗体（#MAB8028-SP） | R&D Systems | MAB8028-SP | |
| PD-L1抗体（#AF1019） | R&D Systems | AF1019 | |
| qRT-PCR | RNeasy试剂盒（#74106） | Qiagen | 74106 |
| High capacity cDNA逆转录试剂盒（#4368813） | Thermo Fisher Scientific | 4368813 | |
| Power SYBR Green PCR Master Mix（#4368708） | Thermo Fisher Scientific | 4368708 | |
| 流式细胞术 | Liberase（#05401127001） | Sigma-Aldrich | 05401127001 |
| OptiPrep密度梯度介质（#AXS-1114542） | Cosmo Bio USA | AXS-1114542 | |
| Live/Dead可固定紫色死细胞染料（#L34955） | Thermo Fisher Scientific | L34955 | |
| CD16/32抗体（#101302） | BioLegend | 101302 | |
| CD45-APC/Cy7抗体（#103116） | BioLegend | 103116 | |
| CD11b-PE/Cy7抗体（#101216） | BioLegend | 101216 | |
| Ly6C-APC抗体（#128016） | BioLegend | 128016 | |
| F4/80-PE抗体（#157304） | BioLegend | 157304 | |
| CCR2-BV605抗体（#150615） | BioLegend | 150615 | |
| 免疫组织化学 | Glypican 3抗体（#MA5-17083） | Thermo Fisher Scientific | MA5-17083 |
| Ki-67抗体（#ab15580） | Abcam | ab15580 | |
| Cleaved Caspase-3抗体（Cell Signaling Technology） | Cell Signaling Technology | -- | |
| 磷酸化MLKL抗体（#ab196436） | Abcam | ab196436 | |
| 磷酸化RIPK3抗体（#ab205421） | Abcam | ab205421 | |
| TUNEL染色 | DeadEnd比色TUNEL系统（#G7130） | Promega | G7130 |
| ELISA | TNFα小鼠高灵敏度ELISA试剂盒（#BMS607-3） | Thermo Fisher Scientific | BMS607-3 |
| IL6小鼠高灵敏度ELISA试剂盒（#BMS603HS） | Thermo Fisher Scientific | BMS603HS | |
| 小鼠CCL2/JE/MCP-1定量ELISA试剂盒（#MJE00B） | R&D Systems | MJE00B | |
| 小鼠甲胎蛋白（AFP）定量ELISA试剂盒（#MAFP00） | R&D Systems | MAFP00 | |
| 小鼠HMGB1 ELISA试剂盒（#E-EL-M0676） | Elabscience | E-EL-M0676 | |
| 生化检测 | ALT比色活性测定试剂盒（#700260） | Cayman Chemical Company | 700260 |
| RNA测序 | NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒（Illumina） | New England Biolabs | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系、基因型（WT、Ripk3−/−、Mlkl−/−）和性别 阅读提示：Materials and Methods: Animals and diet feeding |
| 饮食诱导 | 饮食类型（NC、CD-LFD、CD-HFD）、脂肪比例、喂养周期（6个月） 阅读提示：Materials and Methods: Animals and diet feeding |
| 肿瘤评估 | 肝脏结节计数、分类标准（小于1mm、2-4mm、大于5mm）、肿瘤标志物（Glypican-3、Ki-67、AFP） 阅读提示：Results: Deleting either Ripk3 or Mlkl significantly reduced HCC development; Figure 5 |
| 炎症检测 | 炎症细胞因子（IL6、TNFα、IL1β、CCL2）的转录水平和循环水平、巨噬细胞（F4/80）和单核细胞（CCR2）的比例 阅读提示：Results: Deleting Ripk3 or Mlkl reduced CD-HFD–induced inflammation in male mice; Figures 2 and 3 |
| 纤维化评估 | PSR染色、羟脯氨酸含量、胶原相关基因（Col3α1、Acta2、Col1α1）、TGFβ水平 阅读提示：Results: Blocking necroptosis did not alter CD-HFD–induced liver fibrosis; Figure 4 |
| 信号通路分析 | JNK、β-catenin、PD-L1/PD-1、c-Myc、EpCAM等蛋白表达或磷酸化水平 阅读提示：Results: Oncogenic pathways induced by CD-HFD is attenuated when necroptosis is blocked; Figure 7 |
| 转录组分析 | RNA-seq数据（GSE200923）、差异表达基因、通路分析 阅读提示：Materials and Methods: RNA sequencing and data processing; Results: Gene expression modulation in response to CD-LFD or CD-HFD |