临床样本分析
比较CKD患者与健康对照的肠道菌群差异。
对两组CKD患者队列的粪便样本进行16S rDNA测序和qPCR，分析B. fragilis丰度。
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肠道微生物脆弱拟杆菌改善小鼠肾纤维化
The gut microbe Bacteroides fragilis ameliorates renal fibrosis in mice.
实验完整度
高包含临床样本分析、UUO及腺嘌呤小鼠模型、体外细胞实验、代谢组学、蛋白质组学及分子模拟等多层次验证。
主要模型
UUO小鼠模型 腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型 HK-2细胞 HMC细胞 原代小鼠肾小管上皮细胞（PRTC）
重点核对
B. fragilis活菌口服给药，剂量2×10^8 CFU/ml，每日一次，持续2周 UUO手术和腺嘌呤诱导模型的具体造模方法及给药时间 1,5-AG给药剂量100 mg/kg，腹腔注射，持续7天 羟基积雪草苷（Mad）给药剂量80 mg/kg，口服或腹腔注射 抗体信息：anti-SGLT2 (ab37296, Abcam)等
摘要
肾纤维化是各种进行性慢性肾脏病（CKD）表现的不可避免的结果。因此，对肾纤维化有效治疗方案的需求不容过分强调。在这里，我们展示了脆弱拟杆菌（B. fragilis）在小鼠肾纤维化中的新的保护作用。我们证明了CKD患者和单侧输尿管梗阻（UUO）小鼠粪便中脆弱拟杆菌的丰度降低。口服给予活的脆弱拟杆菌可减轻UUO和腺嘌呤小鼠模型中的肾纤维化。脆弱拟杆菌给药后，升高的脂多糖（LPS）水平降低。代谢组学和蛋白质组学研究结果显示，SGLT2的底物1,5-脱水葡萄糖醇（1,5-AG）水平降低，而脆弱拟杆菌给药后通过增强肾脏SGLT2表达使其水平升高。1,5-AG是TGR5的激动剂，通过抑制氧化应激和炎症减轻肾纤维化。通过体外筛选发现的天然产物羟基积雪草苷（Madecassoside）可促进脆弱拟杆菌生长并显著改善肾纤维化。我们的发现揭示了脆弱拟杆菌通过降低LPS和增加1,5-AG水平来改善肾纤维化的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脆弱拟杆菌（B. fragilis）是否能够改善肾纤维化，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- B. fragilis通过降低LPS水平和上调肾脏SGLT2表达，增加血清1,5-AG水平；1,5-AG作为TGR5激动剂，抑制氧化应激和炎症，从而减轻肾纤维化。
- 主要证据
- 在UUO和腺嘌呤小鼠模型中，口服活B. fragilis减轻肾纤维化；代谢组学和蛋白质组学显示1,5-AG和SGLT2变化；体外实验和分子模拟证实1,5-AG结合TGR5和SGLT2。
- 研究意义
- 调节肠道微生物群可能成为进行性肾纤维化的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
UUO小鼠模型验证
评估口服B. fragilis对UUO小鼠肾纤维化的影响。
对UUO小鼠口服活或热灭活B. fragilis，检测肾功能、肾组织学、纤维化标志物、炎症和氧化应激指标。
代谢组学和蛋白质组学分析
探索B. fragilis改善肾纤维化的代谢和蛋白质组变化。
对UUO小鼠血清进行GC-MS非靶向和靶向代谢组学，对肾脏进行非标记定量蛋白质组学，分析差异代谢物和蛋白。
体内验证1,5-AG的作用
验证1,5-AG对UUO小鼠肾纤维化的保护作用。
对UUO小鼠给予1,5-AG，检测肾功能、组织学、纤维化标志物、氧化应激和TGF-β/Smad通路。
体外细胞实验及TGR5验证
验证1,5-AG对TGR5的激动作用及其抗纤维化依赖TGR5。
在HK-2、HMC和PRTC细胞中给予1,5-AG，检测纤维化标志物和炎症因子；敲低TGR5或使用拮抗剂SBI-115观察抗纤维化效果。
SGLT2作为1,5-AG转运体的验证
验证SGLT2负责肾脏对1,5-AG的重吸收。
通过分子对接和MD模拟分析1,5-AG与SGLT2结合；用恩格列净抑制SGLT2后测量血清1,5-AG水平；在SGLT2过表达的HEK293细胞中检测1,5-AG摄取。
筛选并验证羟基积雪草苷（Mad）的作用
筛选可促进B. fragilis生长的天然产物，并验证其对肾纤维化的保护作用。
体外筛选14种天然产物对B. fragilis生长的影响；在UUO模型中口服或腹腔注射Mad，并联合抗生素清除肠道菌群，检测肾纤维化指标。
腺嘌呤模型验证
在第二个模型中确认B. fragilis、1,5-AG和Mad的抗纤维化作用。
用腺嘌呤诱导CKD小鼠，分别给予B. fragilis、1,5-AG或Mad，检测肾功能、组织学、纤维化和SGLT2表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 肠道菌群分析 | E.Z.N.A.®粪便DNA提取试剂盒 | Omega | D4015 |
| TIANamp粪便DNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP328 | |
| qPCR | AceQ qPCR SYBR Green预混液 | Vazyme Biotech Co. Ltd. | -- |
| StepOne实时荧光定量PCR系统 | A&B | -- | |
| 16S rDNA测序 | AMPure XT磁珠 | Beckman Coulter Genomics | -- |
| Qubit荧光计 | Invitrogen | -- | |
| Agilent 2100生物分析仪 | Agilent | -- | |
| Illumina文库定量试剂盒 | Kapa Biosciences | -- | |
| 测序平台 | Illumina NovaSeq平台 | Illumina | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | C11330500BT |
| DMEM培养基 | BI | 01-052-1ACS | |
| 胎牛血清 | BI | 04-001-1ACS | |
| 青霉素/链霉素 | Sangon Biotech | B540732 | |
| 细胞处理 | 重组人TGF-β1蛋白 | R&D system | -- |
| 脂多糖 | Sigma | L2630 | |
| 高糖 | Sangon Biotech | A100188 | |
| 1,5-脱水葡萄糖醇 | Omicron Biochrmicals | BYOC-ALD-070-1g | |
| SBI-115（TGR5拮抗剂） | MedChemExpress | HY-111534 | |
| 动物实验 | 羟基积雪草苷 | FeiYu Biotech Co Ltd | -- |
| 羟基积雪草酸 | FeiYu Biotech Co Ltd | -- | |
| 庆大霉素 | YuanYe Bio-Technology Co Ltd | -- | |
| 新霉素 | YuanYe Bio-Technology Co Ltd | -- | |
| 甲硝唑 | YuanYe Bio-Technology Co Ltd | -- | |
| 万古霉素 | YuanYe Bio-Technology Co Ltd | -- | |
| 恩格列净 | GlpBio Technology | -- | |
| Western blot | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0009 |
| PVDF转印膜 | Merk Millipore | IPVH00010 | |
| 抗胶原I抗体 | Abcam | ab260043 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Abcam | ab2413 | |
| 抗α-SMA抗体 | Abcam | ab124964 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | HRP-60004 | |
| 抗TGF-β1抗体 | Proteintech | 21898-1-AP | |
| 抗Smad2抗体 | CST | #5339 | |
| 抗Smad3抗体 | CST | #9523 | |
| 抗12-LO (C-5)抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365194 | |
| 抗Rac1抗体 | Proteintech | 66122-1-Ig | |
| 抗Nrf2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP | |
| 抗Keap1抗体 | Proteintech | 10503-2-AP | |
| 抗HO-1抗体 | Proteintech | 66743-1-Ig | |
| 抗SGLT2抗体 | Abcam | ab37296 | |
| 抗ZO-1抗体 | Proteintech | 21773-1-AP | |
| 抗Occludin抗体 | Proteintech | 66378-1-Ig | |
| 抗TGR5抗体 | Abcam | ab72608 | |
| 抗IL-1β抗体 | Abcam | ab254360 | |
| 抗TNF-α抗体 | Abcam | ab215188 | |
| 抗IL-6抗体 | Abcam | ab259341 | |
| 抗Vimentin抗体 | CST | #5741 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | CST | #14472 | |
| HRP标记的抗兔IgG | CST | #7074 | |
| HRP标记的抗小鼠IgG | CST | #7076 | |
| RNA提取 | RNAiso Plus（RNA提取试剂） | Takara Bio | -- |
| 逆转录 | HiScript II QRT SuperMix（qPCR逆转录试剂） | Vazyme | R233-01 |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 555标记的山羊抗兔IgG | Abcam | ab150078 |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG | Proteintech | SA00003-1 | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| LSM700共聚焦激光扫描显微镜 | Zeiss | -- | |
| 免疫组化 | HRP标记的山羊抗兔IgG | AiFang biology | AFIHC003 |
| Leica DMi8荧光显微镜 | Leica | -- | |
| ELISA | 人LPS ELISA试剂盒 | MSKBIO | KT98561 |
| 小鼠LPS ELISA试剂盒 | MSKBIO | KT37561 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | MSKBIO | KT21178 | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | MSKBIO | KT99854 | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | MSKBIO | KT99985 | |
| cAMP ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-0056c | |
| 生化分析 | Chemray 240全自动生化分析仪 | Redu Life Technology | -- |
| GC-MS | Agilent 7890色谱仪联用5977B质谱仪 | Agilent Technologies | -- |
| LC-MS | UltiMate 3000超高效液相色谱系统 | DIONEX | -- |
| ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱 | Waters | -- | |
| TSQ Vantage三重四极杆质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质组学 | EASY-nLC 1200系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞转染 | INTERFER转染试剂 | -- | -- |
| 慢病毒转染 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 分子模拟 | AutoDock | -- | -- |
| Amber程序 | -- | -- | |
| AlphaFold2 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | CKD患者和健康对照的样本量、来源医院、B. fragilis检测方法（qPCR） 阅读提示：Methods: Recruitment of patients with CKD and healthy controls |
| UUO小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别、UUO手术细节、B. fragilis给药剂量和频率（2×10^8 CFU/ml每日灌胃）、对照组设置 阅读提示：Methods: Animal models; Treatment strategies |
| 腺嘌呤模型 | 腺嘌呤剂量（80 mg/kg）、给药时间（3周）、B. fragilis/1,5-AG/Mad的给药方案 阅读提示：Methods: Animal models; Treatment strategies |
| 代谢组学和蛋白质组学 | 血清样本制备、GC-MS/LC-MS参数、蛋白质组学方法、差异筛选标准（VIP≥1.0, adjusted p≤0.05） 阅读提示：Methods: Serum sample preparation; GC-MS analysis; Label-free quantitative proteomics |
| 体外细胞实验 | 细胞系（HK-2, HMC, PRTC）、处理条件（TGF-β1浓度10 ng/mL, 高糖30 mM, 1,5-AG浓度50 μM）、TGR5敲低/拮抗剂处理 阅读提示：Methods: Cell culture and treatments; Small-interfering RNA (siRNA) and transient transfection |
| SGLT2功能验证 | HEK293细胞转染SGLT2、摄取实验条件（1,5-AG-13C6浓度100 μM）、恩格列净使用剂量 阅读提示：Methods: Lentiviral and plasmid package and cell transfection; Uptake study for 1,5-AG |