EAP模型建立与验证
构建EAP小鼠模型并确认前列腺炎症和盆腔疼痛。
用大鼠雄激素结合蛋白（PBS）和完全弗氏佐剂免疫NOD小鼠，两周后加强免疫；通过HE染色和Von Frey纤维检测炎症和疼痛。
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肠道微生物通过短链脂肪酸丙酸调节实验性自身免疫性前列腺炎中Th17/Treg细胞分化
Gut Microflora Modulates Th17/Treg Cell Differentiation in Experimental Autoimmune Prostatitis via the Short-Chain Fatty Acid Propionate.
实验完整度
高包含体外细胞分化实验、体内动物模型、粪便微生物组测序、代谢组学、粪便移植及机制验证（GPR43-HDAC6通路）。
主要模型
小鼠EAP模型（NOD小鼠皮下免疫诱导） 体外分化的CD4+T细胞（Th17/Treg条件）
重点核对
EAP模型建立：皮下免疫两次，对照组用生理盐水 丙酸补充：饮水中150 mM，每日新鲜配制，处理7天 GPR43敲低：LV-Sh GPR43转染，体内前列腺内注射，体外慢病毒感染 流式细胞术检测Th17（CD4+IL-17+）和Treg（CD4+CD25+FoxP3+）频率 粪便移植：抗生素处理小鼠后灌胃粪便悬液2周
摘要
慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征（CP/CPPS）是一种非常常见的泌尿系统疾病，并逐渐被认为是一种免疫介导的疾病。多项研究表明，肠道微生物在免疫稳态和自身免疫性疾病发展中起着关键作用。然而，肠道微生物是否影响CP/CPPS，以及其潜在机制仍不清楚。在这里，我们通过皮下免疫构建了实验性自身免疫性前列腺炎（EAP）小鼠模型，并发现其Th17/Treg频率失衡。通过粪便16s rRNA测序和非靶向/靶向代谢组学，我们发现对照组和EAP组之间肠道微生物的多样性和相对丰度及其代谢物明显不同。与对照组相比，EAP小鼠中的丙酸（一种短链脂肪酸（SCFA））降低，补充丙酸可降低EAP的易感性，并在体内和体外纠正Th17/Treg细胞分化的失衡。此外，还评估了丙酸在Th17和Treg细胞中调节的SCFA受体G蛋白偶联受体43和细胞内组蛋白去乙酰化酶6。最后，我们观察到来自EAP小鼠的粪便移植诱导受体小鼠中Treg细胞频率的降低。我们的数据表明，肠道菌群失调通过代谢物丙酸的减少促进了EAP中Th17/Treg分化失衡，并为通过靶向丙酸进一步干预CP/CPPS的免疫紊乱提供了宝贵的免疫学基础。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道微生物及其代谢产物是否通过影响Th17/Treg细胞分化参与EAP的发病机制？
- 核心机制
- 肠道菌群失调导致SCFA丙酸减少，丙酸通过激活GPR43并抑制HDAC6来调节Th17/Treg细胞分化，从而影响EAP的炎症反应。
- 主要证据
- EAP小鼠粪便和血清中丙酸水平降低；丙酸补充在体内和体外均恢复Th17/Treg平衡；LV-shGPR43敲低逆转丙酸效应，导致Th17/Treg失衡；粪便移植EAP菌群降低受体小鼠Treg频率。
- 研究意义
- 研究为通过补充微生物代谢产物（如丙酸）进行饮食干预以改善CP/CPPS患者的免疫紊乱提供了新的视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
Th17/Treg细胞频率及细胞因子检测
检测EAP小鼠脾脏和前列腺中Th17和Treg细胞比例及炎症因子水平。
分离脾脏淋巴细胞，流式细胞术检测CD4+IL-17+、CD4+RORγt+和CD4+CD25+FoxP3+细胞；ELISA检测血清和前列腺组织中的IL-17、IL-10、TGF-β等。
粪便16S rRNA测序和代谢组学分析
分析EAP小鼠与对照小鼠肠道微生物组成和代谢产物差异。
提取粪便DNA，扩增V3-V4区，Illumina MiSeq测序；粪便代谢物提取，GC-MS非靶向和靶向代谢组学。
丙酸补充实验
验证丙酸对EAP小鼠炎症和Th17/Treg失衡的治疗作用。
EAP小鼠饮水中添加丙酸（150 mM）处理7天，检测前列腺炎症、疼痛、Th17/Treg比例及细胞因子。
体外分化实验
验证丙酸对初始CD4+T细胞分化为Th17和Treg的直接影响。
分选初始CD4+T细胞，在Th17或Treg分化条件下加或不加丙酸（10μg/ml）培养5天，流式检测Th17和Treg比例。
机制验证：GPR43-HDAC6轴
验证丙酸通过GPR43和HDAC6调节Th17/Treg分化的机制。
使用LV-shGPR43敲低GPR43，检测GPR43蛋白表达、HDAC6 mRNA和蛋白水平，以及Th17/Treg比例变化；体内敲低后免疫组化检测GPR43和HDAC6。
粪便移植实验
验证EAP菌群是否可转移免疫失衡。
用抗生素处理小鼠构建伪无菌小鼠，然后灌胃对照组或EAP小鼠粪便悬液2周，检测受体小鼠Th17/Treg比例。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| EAP模型建立 | 完全弗氏佐剂 | Sigma | -- |
| 不完全弗氏佐剂 | Sigma | -- | |
| 细胞培养与分化 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯 | MultiSciences | -- |
| 离子霉素 | MultiSciences | -- | |
| 莫能菌素 | MultiSciences | -- | |
| 细胞分选 | CD4+ T细胞分选试剂盒 | Miltenyi | 130-104-454 |
| LS分离柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 细胞分化刺激 | 抗CD3抗体 | Bio X Cell | BE0001-1 |
| 抗CD28抗体 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| 抗IL-4抗体 | Bio X Cell | BE0045 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Bio X Cell | BE0055 | |
| 重组小鼠IL-6 | Novoprotein | CG39 | |
| 重组小鼠TGF-β1 | Novoprotein | CA59 | |
| 重组小鼠IL-23 | Novoprotein | CS31 | |
| 重组小鼠IL-2 | Novoprotein | CK24 | |
| 流式细胞术 | FITC-CD4抗体 | BD | 553046 |
| APC-CD25抗体 | BD | 557192 | |
| PE-IL-17A抗体 | BD | 559502 | |
| PE-RORγt抗体 | ebioscience | 12-6981-60 | |
| PE-FoxP3抗体 | BD | 563101 | |
| FACSCalibur流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| GPR43抗体 | Genetex | 00823 | |
| GAPDH抗体 | Elabscience | -- | |
| 二抗（抗兔/鼠IgG） | Elabscience | -- | |
| 增强化学发光系统 | Hengmei Technology | ChemiScope | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| FastQuant逆转录试剂盒 | Tiangen Biotech | -- | |
| SuperReal PreMix Plus试剂盒 | Tiangen Biotech | -- | |
| ABI 7500 PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒（用于IL-17、IL-10、TGF-β等） | Elabscience | -- |
| 16S rRNA测序 | QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT试剂盒 | QIAGEN | -- |
| Illumina MiSeq PE300测序系统 | Illumina | -- | |
| 代谢组学 | Agilent 7890B气相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| Agilent 5977A质谱检测器 | Agilent Technologies | -- | |
| Nexera UHPLC LC-30A高效液相色谱仪 | Shimadzu | -- | |
| AB Sciex Qtrap 5500质谱仪 | AB Sciex | -- | |
| 慢病毒感染 | LV-Sh GPR43慢病毒 | Hanbio Biotechnology | HH20211029RFF-LV01 |
| LV-Sh Control慢病毒 | Hanbio Biotechnology | -- | |
| 免疫组化 | GPR43抗体（兔，IHC） | Genetex | 00823 |
| IL-17抗体（兔，IHC） | Servicebio | -- | |
| FoxP3抗体（兔，IHC） | Servicebio | -- | |
| HDAC6抗体（小鼠，IHC） | Genetex | 84377 | |
| 二抗（山羊抗兔/鼠IgG） | Servicebio | -- | |
| 数字切片扫描仪Pannoramic MIDI | 3DHistech | -- | |
| 动物实验 | 硫酸新霉素 | Sigma | -- |
| 甲硝唑 | Sigma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EAP模型建立 | 小鼠品系、周龄、体重；免疫原（大鼠雄性副性腺提取物）和佐剂（CFA/IFA）来源；注射部位和体积；免疫时间点；对照组处理。 阅读提示：Materials and Methods: Animals, Mouse Model of EAP; Figure 1A |
| Th17/Treg流式检测 | 脾脏淋巴细胞分离方法；抗体克隆号和荧光标记；刺激物（PMA、离子霉素、莫能菌素）浓度和孵育时间；固定/破膜条件；流式细胞仪型号。 阅读提示：Materials and Methods: Flow Cytometry; Figure 1E-J |
| 丙酸补充实验 | 丙酸浓度（150 mM）、给药方式（饮水）、给药频率（每周新鲜配制）、处理持续时间（7天）、对照组设置。 阅读提示：Materials and Methods: SCFA Propionate Treatment Assays; Figure 5A |
| 体外分化实验 | CD4+ T细胞分选方法；Th17/Treg分化条件（细胞因子和抗体浓度）；丙酸浓度（10μg/ml）；培养时间（5天）；检测指标。 阅读提示：Materials and Methods: Isolation and In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells; Figure 6 |
| GPR43敲低 | LV-Sh GPR43和对照慢病毒的来源、滴度、感染方法（体外moi或体内注射剂量/部位/时间）；敲低效率验证（Western blot）；对Th17/Treg分化的影响。 阅读提示：Materials and Methods: Lentivirus Infection; Figure 7 |
| 粪便移植 | 受体小鼠抗生素处理剂量和时间；粪便悬液制备（稀释倍数）；灌胃体积和频率；总持续时间；供体EAP模型时间点。 阅读提示：Materials and Methods: Pseudo Germ-Free Mice Modeling and Fecal Microbiota Transplantation; Figure 8A |