Pantoprazole Attenuates MAPK (ERK1/2, JNK, p38)-NF-κB and Apoptosis Signaling Pathways after Renal Ischemia/Reperfusion Injury in Rats.
包含生化分析、组织病理、qRT-PCR和Western blot等多个独立实验层级，并进行了功能验证（凋亡基因和蛋白表达）及机制验证（MAPK和NF-κB通路），且设置了阳性对照。
雄性Wistar白化大鼠肾缺血/再灌注损伤模型
给药剂量：单剂量PTZ 160 mg/kg（腹腔注射），多剂量PTZ 40 mg/kg（口服）每日两次，持续十天 肾缺血时间：双侧肾蒂夹闭45分钟后再灌注 动物品系和样本量：雄性Wistar白化大鼠，n=8 生化指标检测：血清BUN、Scr、MDA水平 统计方法：单因素方差分析后Student's t检验，p≤0.05为显著
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建大鼠肾缺血/再灌注损伤模型，并评估泮托拉唑单剂量或多剂量给药对该模型的影响。
将雄性Wistar大鼠分为8组，每组8只，包括正常对照、假手术、PTZ单剂量、PTZ多剂量、IRI、IRI+PTZ单剂量、IRI+PTZ多剂量和IRI+孟鲁司特（阳性对照）。通过双侧肾蒂夹闭45分钟后再灌注建立IRI模型。按方案给予泮托拉唑（单剂量160 mg/kg腹腔注射；多剂量40 mg/kg口服每日两次，持续十天）或对照。
检测IRI及泮托拉唑治疗对肾功能指标（BUN、Scr）和氧化应激标志物（MDA）的影响。
使用试剂盒测定血清中BUN、Scr和MDA水平。
评估IRI及泮托拉唑治疗对促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的影响。
使用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。
评估IRI及泮托拉唑治疗对凋亡相关基因Bax和Bcl-2 mRNA表达的影响。
使用qRT-PCR检测肾组织中Bax和Bcl-2的mRNA水平，以GAPDH作为内参，采用2^(-ΔΔCt)法计算相对表达量。
评估IRI及泮托拉唑治疗对MAPK（ERK1/2、JNK、p38）、NF-κB以及凋亡相关蛋白表达的影响。
使用Western blot检测肾组织中p-JNK1/2、p-ERK1/2、p-p38、cleaved caspase-3和NF-κB的蛋白表达水平，并以β-actin作为内参。
评估IRI及泮托拉唑治疗对肾组织形态学损伤的影响。
取肾组织进行HE染色，观察肾皮质、皮髓质和髓质的组织学改变。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 泮托拉唑钠 | Taketa GmbH company | 98% |
| 药物处理（阳性对照） | 孟鲁司特 | Sedico Pharmaceutical Company | -- |
| 生化分析 | 肌酐测定试剂盒 | human diagnostic | 10051 |
| 尿素氮测定试剂盒 | human diagnostic | 10505 | |
| 丙二醛检测试剂盒 | Biodiagnostic | MD | |
| 炎症因子检测 | TNF-α ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R001996T |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R001296T | |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-R001596T | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Amresco | -- |
| cDNA合成 | RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Science Fermentas | K1632 |
| qRT-PCR | Maxima SYBR Green qPCR预混液(2X) | Thermo Scientific Fermentas | K0251 |
| Western blot | T-PER蛋白提取试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| PVDF膜 | EMD Millipore | -- | |
| p-38抗体 | Cell Signaling Technology | 8690 | |
| 磷酸化p-38抗体 | Cell Signaling Technology | 4511 | |
| 磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| NF-κB p65抗体 | Abcam | Ab32536 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4672 | |
| 磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9662 | |
| β-actin抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1615 | |
| ECL检测系统 | Amersham Bioscience | -- | |
| Gel-Pro Analyzer 6.0 软件 | Media Cybernetics | -- | |
| 超声破碎 | SFX 550 Branson数字超声破碎仪 | Branson | -- |
| 组织学检查 | 滑动切片机 | -- | -- |
| 光学显微镜 | Olympus | BH | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 7 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 动物品系：雄性Wistar大鼠；体重255-300g；周龄6-9周；样本量每组8只。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.2 Animals and Care & 4.3 Experimental Design |
| IRI手术 | 缺血时间45分钟；通过夹闭双侧肾蒂实现；再灌注通过移除夹子。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.2 Animals and Care |
| 药物处理 | PTZ单剂量：160 mg/kg腹腔注射；PTZ多剂量：40 mg/kg口服，每天两次，持续10天；孟鲁司特：10 mg/kg腹腔注射。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.3 Experimental Design |
| 生化检测 | BUN和Scr试剂盒型号（#10505和#10051）；MDA试剂盒型号（MD 2529）。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.4 Biochemical Analysis |
| qRT-PCR | 引物序列（Bax、Bcl-2、GAPDH）；SYBR Green qPCR Master Mix；cDNA合成试剂盒；扩增条件（95°C 10s, 60°C 1min, 30循环）。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.6 qRT-PCR，表1 |
| Western blot | 抗体信息（p38、p-p38、ERK等）；蛋白上样量50 μg；使用PVDF膜。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.7 Western Blotting Analysis |
| 组织病理学 | 组织固定于10%福尔马林，石蜡包埋，切片的厚度4μm，进行HE染色。 阅读提示：见Materials and Methods, 4.8 Histological Examination |
