RNA-seq筛选EGF靶基因
鉴定EGF处理后人滋养层细胞中受调控的基因，寻找潜在下游靶基因。
对HTR-8/SVneo细胞用100 ng/mL EGF处理24小时，进行RNA-seq分析，筛选差异表达基因，并通过GO、DO、KEGG富集分析。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
EGF通过下调ID3介导的KISS1表达刺激人滋养层细胞侵袭
EGF stimulates human trophoblast cell invasion by downregulating ID3-mediated KISS1 expression.
实验完整度
高包含RNA-seq转录组分析、细胞功能实验（侵袭实验）、机制验证（信号通路抑制剂、siRNA敲低、过表达）以及临床样本（PE患者血清和胎盘）验证，证据层级多样且含功能与机制验证。
主要模型
HTR-8/SVneo人滋养层细胞系 PE患者血清样本 PE患者胎盘组织
重点核对
EGF处理浓度和时间（50 ng/mL，24 h） EGFR抑制剂AG1478（5 µM）和HER2抑制剂AG825（5 µM）的预处理 siRNA敲低EGFR（50 nM）和过表达ID3/KISS1（1 µg质粒） 侵袭实验条件（1×10^5细胞/insert，48 h，Matrigel包被） 临床样本分组（17例PE患者和16例正常孕妇）
摘要
背景：在妊娠期间，滋养层细胞的侵袭需要被精细调控。异常的滋养层细胞侵袭与胎盘疾病相关。表皮生长因子（EGF）及其受体EGFR在滋养层细胞中表达。尽管已有报道EGF对滋养层细胞具有促侵袭作用，但其潜在机制仍 largely unknown。结果：在本研究中，我们对EGF刺激的HTR-8/SVneo人滋养层细胞进行了RNA测序，并确定KISS1为EGF的靶基因。人KISS1基因编码kisspeptin，也称为metastin，可抑制肿瘤转移。我们的结果表明，EGF处理通过激活EGFR介导的PI3K/AKT信号通路下调KISS1的表达和分泌。此外，DNA结合蛋白抑制剂3（ID3）的表达被EGF下调，且ID3下调是EGF抑制KISS1表达所必需的。在功能上，transwell侵袭实验表明，EGF通过下调KISS1表达刺激人滋养层细胞侵袭。子痫前期（PE）是一种以滋养层细胞侵袭不足为特征的胎盘疾病。我们的临床结果显示，PE患者血清中EGF水平下调，而血清和胎盘中的KISS1水平上调。结论：本研究证明，EGF的下调可通过增加KISS1表达导致滋养层细胞侵袭不良，进而促进PE的发病机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EGF促进人滋养层细胞侵袭的分子机制是什么？
- 核心机制
- EGF通过激活EGFR介导的PI3K/AKT信号通路下调ID3表达，进而抑制KISS1表达和分泌，从而促进滋养层细胞侵袭。
- 主要证据
- RNA-seq鉴定KISS1为EGF靶基因；RT-qPCR和Western blot验证EGF下调KISS1；抑制剂和siRNA证明EGFR和PI3K/AKT通路参与；ID3过表达逆转EGF对KISS1的抑制；侵袭实验证明EGF通过下调KISS1促进侵袭；PE患者血清和胎盘中KISS1上调。
- 研究意义
- 揭示了EGF调控KISS1表达的新机制，增进了对EGF/EGFR在人胎盘中生物学作用的理解，并为PE的发病机制提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EGF对KISS1表达和分泌的抑制
确认EGF下调KISS1 mRNA和蛋白水平，并影响其分泌。
用不同浓度和时间EGF处理HTR-8/SVneo细胞，通过RT-qPCR和Western blot检测KISS1表达，ELISA检测培养上清中KISS1分泌。
验证EGFR和HER2在EGF抑制KISS1中的作用
确定EGF下调KISS1是否依赖EGFR或HER2。
使用EGFR抑制剂AG1478和HER2抑制剂AG825预处理细胞，或siRNA敲低EGFR，检测KISS1表达变化。
探究下游信号通路（PI3K/AKT和ERK1/2）
确定EGF抑制KISS1表达所依赖的细胞内信号通路。
使用PI3K抑制剂LY294002和MEK抑制剂U0126预处理细胞，检测KISS1表达和分泌变化，以及信号通路磷酸化状态。
验证ID3在EGF抑制KISS1中的作用
确定ID3是否介导EGF对KISS1的抑制。
检测EGF对ID3表达的影响，并通过过表达ID3观察对KISS1表达的影响。
功能实验验证EGF通过KISS1促进细胞侵袭
验证EGF促进滋养层细胞侵袭是否通过下调KISS1实现。
使用Transwell侵袭实验检测EGF处理、ID3或KISS1过表达、KP-10处理后的细胞侵袭能力。
临床样本验证
在PE患者中检测EGF和KISS1水平，验证研究发现的临床相关性。
收集PE患者和正常孕妇的血清，通过ELISA检测EGF和KISS1水平；通过免疫组化检测胎盘组织KISS1和ID3表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F-12培养基 | Gibco | -- |
| 活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素和硫酸链霉素 | Boster | -- | |
| 药物处理 | 表皮生长因子 | Sigma | -- |
| AG1478（EGFR抑制剂） | Sigma | -- | |
| AG825（HER2抑制剂） | Sigma | -- | |
| LY294002（PI3K抑制剂） | Sigma | -- | |
| U0126（MEK抑制剂） | Cayman | -- | |
| Kisspeptin-10 | Tocris | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA-seq文库构建 | NEBNext® Ultra™ II RNA文库制备试剂盒 | NEB | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- |
| RT-qPCR | RNeasy Plus Mini试剂盒 | QIAGEN | -- |
| iScript逆转录试剂盒 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| SYBR Green PCR预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| QuantStudio 12K Flex系统 | Applied Biosystems | -- | |
| Western blot | 细胞裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Pierce, Thermo Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 增强化学发光底物 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| ChemiDoc MP成像仪 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| KISS1抗体 | abcam | ab226786 | |
| ID3抗体 | Cell Signaling Technology | 9837 | |
| 磷酸化EGFRTyr1068抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| 磷酸化EGFRTyr1173抗体 | Cell Signaling Technology | 4407 | |
| EGFR抗体 | Cell Signaling Technology | 4267 | |
| 磷酸化HER2Tyr1221/1222抗体 | Cell Signaling Technology | 2243 | |
| HER2抗体 | Cell Signaling Technology | 2165 | |
| 磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9106 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 磷酸化AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9271 | |
| AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| α-微管蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23948 | |
| siRNA转染 | 靶向人EGFR的ON-TARGETplus SMARTpool siRNA | Dharmacon | -- |
| ON-TARGETplus siCONTROL非靶向池siRNA | Dharmacon | -- | |
| Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 过表达 | 编码人全长ID3或KISS1的pCMV载体 | GeneChem | -- |
| Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| ELISA | 人KISS1 ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H6099 |
| 人EGF ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0059 | |
| 侵袭实验 | Transwell细胞培养小室（8 µm孔径，24孔） | BD Biosciences | -- |
| 生长因子减少型Matrigel | BD Biosciences | -- | |
| 结晶紫 | Sigma | -- | |
| 免疫组化 | KISS1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-101246 |
| ID3抗体 | OriGene | CF500714 | |
| 过氧化物酶/DAB Dako REAL EnVision检测系统 | Dako | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| RNA-seq实验 | EGF处理浓度100 ng/mL，处理时间24 h，重复3次 阅读提示：Materials and methods: RNA sequencing and analysis; Figure 1 |
| RT-qPCR | 引物序列、qPCR反应体系（1X SYBR Green PCR Master Mix、60 ng cDNA、250 nM引物）、内参基因GAPDH、三复孔 阅读提示：Materials and methods: Reverse transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR) |
| Western blot | 细胞裂解液、BCA定量、上样量50 µg、一抗稀释比例 阅读提示：Materials and methods: Western blot |
| 侵袭实验 | Transwell孔径8 µm、Matrigel浓度1 mg/mL、细胞数1×10^5/insert、孵育48 h、0.1% FBS vs 10% FBS梯度 阅读提示：Materials and methods: Invasion assay; Figure 5 |
| siRNA转染 | siRNA浓度50 nM，转染试剂Lipofectamine RNAiMAX，转染时间48 h 阅读提示：Materials and methods: Small interfering RNA (siRNA) transfection and overexpression |
| 过表达 | 质粒用量1 µg，转染试剂Lipofectamine 3000，转染时间48 h 阅读提示：Materials and methods: Small interfering RNA (siRNA) transfection and overexpression |
| 抑制剂处理 | AG1478和AG825浓度5 µM，预处理1 h；LY294002和U0126浓度5 µM，预处理1 h 阅读提示：Materials and methods: Cell culture and reagents; Figures 2,3,4,5 |
| ELISA | 试剂盒型号，CV<10% 阅读提示：Materials and methods: ELISA assay |
| 临床样本检测 | PE患者和对照的年龄、孕周匹配；样本量17例PE和16例对照；检测血清EGF和KISS1；胎盘组织免疫组化 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry; Figure 6 |