原代星形胶质细胞培养与模型建立
获得hSOD1(G93A)和hSOD1(WT)小鼠的脊髓星形胶质细胞，用于后续分析。
从新生小鼠（1-2天）脊髓分离细胞，培养2周，达到95%纯度。
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hSOD1(G93A) ALS小鼠模型原代星形胶质细胞蛋白质组和分泌代谢物的扰动
Perturbations of the Proteome and of Secreted Metabolites in Primary Astrocytes from the hSOD1(G93A) ALS Mouse Model.
实验完整度
高包含体外原代星形胶质细胞模型，结合非靶向代谢组学、TMT定量蛋白质组学、Western blot验证、转录因子活性检测等多层级验证。
主要模型
hSOD1(G93A)转基因小鼠原代脊髓星形胶质细胞 hSOD1(WT)转基因小鼠原代脊髓星形胶质细胞
重点核对
星形胶质细胞纯化：新生小鼠（1-2天龄）原代脊髓星形胶质细胞，纯度≥95% 代谢组学样本：每基因型15个条件培养基样本，负离子模式HILIC-HRMS 蛋白质组学样本：每基因型3个生物学重复，TMT 6-plex标记定量，筛选标准：变化倍数>1.33或<0.77，p<0.05 Western blot验证：GCLC、GSTO1、Cath B、Cath Z、PSMD8、Gelsolin，n=5 转录因子活性：NF-kB核转位及IKKα/β、IkBα磷酸化，n=4
摘要
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种进行性神经退行性疾病，其病理生理学在很大程度上是未知的。尽管运动神经元（MN）死亡被认为是ALS的关键事件，但星形胶质细胞功能障碍和神经炎症已被证明伴随甚至可能驱动MN丢失。然而，引发星形胶质细胞衰竭和过度激活的机制仍不清楚。在这项工作中，通过研究过表达人(h)SOD1(G93A)蛋白的转基因ALS小鼠模型与原代脊髓星形胶质细胞相比，其分泌代谢组和细胞蛋白质组的变化，揭示了ALS星形胶质细胞中改变的途径和分子。在这里，我们表明ALS原代星形胶质细胞中参与谷胱甘肽代谢和信号传导的蛋白质和分泌代谢物减少。观察到的Nf-kB、Ebf1和Plag1转录因子活化增加可能解释了参与蛋白酶体或内体-溶酶体系统介导的蛋白水解途径的蛋白质表达增加。此外，hSOD1(G93A)原代星形胶质细胞也表现出脂质代谢的改变。我们的结果为可能构成ALS星形胶质细胞功能障碍和星形胶质细胞-MN串扰改变基础的分子途径提供了新的见解，代表了在疾病发病机制中消除或减缓MN死亡潜在的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ALS中星形胶质细胞功能障碍和过度激活的分子机制尚不清楚。
- 核心机制
- hSOD1(G93A)星形胶质细胞中谷胱甘肽代谢受损，NF-kB、Ebf1和Plag1转录因子活化，导致蛋白酶体/内体-溶酶体系统蛋白表达增加。
- 主要证据
- 基于原代脊髓星形胶质细胞，通过非靶向代谢组学与TMT蛋白质组学发现GSH代谢物和蛋白耗竭、蛋白水解相关蛋白上调，Western blot验证部分蛋白变化，并检测到NF-kB活化及Ebf1、Plag1上调。
- 研究意义
- 研究揭示的分子通路可能作为治疗靶点，以阻止或延缓ALS中运动神经元死亡。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分泌代谢组学分析
比较hSOD1(G93A)和hSOD1(WT)星形胶质细胞分泌代谢物的差异。
收集条件培养基，通过UHPLC-HRMS进行非靶向代谢组学分析。
蛋白质组学分析
比较hSOD1(G93A)和hSOD1(WT)星形胶质细胞蛋白质表达谱的差异。
细胞裂解后，用TMT 6-plex标记，进行shot-gun蛋白质组学分析。
Western blot验证
验证蛋白质组学发现的差异蛋白表达。
对GCLC、GSTO1、Cath B、Cath Z、PSMD8、Gelsolin进行Western blot分析。
转录因子结合位点预测
预测调控差异表达基因的转录因子。
使用oPOSSUM、Pscan和TFM explorer三种算法分析启动子区域。
转录因子表达与活性验证
验证预测转录因子的表达和活性。
通过qRT-PCR检测转录因子mRNA表达，通过Western blot检测NF-kB信号通路活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证代谢变化
验证分子表达变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 最低必需培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 代谢组学分析 | Ultimate 3000超高效液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q-Exactive质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| Zic-HILIC色谱柱 | Merck | -- | |
| 代谢组学数据分析 | Compound Discoverer软件 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SIMCA-P软件 | Umetrics | -- | |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Roche | -- |
| 蛋白质定量 | Lowry法蛋白定量试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 蛋白质组学样本制备 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| TMT 6-plex标记试剂 | Thermo Scientific | -- | |
| C18 BioPure离心柱 | Nest Group | -- | |
| 蛋白质组学分析 | Aeris肽C18色谱柱 | Phenomenex | -- |
| 蛋白质组学数据分析 | Proteome Discoverer 1.4软件 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SEQUEST HT搜索引擎 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| MeV软件 | SourgeForge | -- | |
| Western blot | Mini-Protean TGX预制胶 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| 增强化学发光试剂盒 | EMD Millipore | -- | |
| UVItec成像系统 | Eppendorf | -- | |
| 抗组织蛋白酶B抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-365558 | |
| 抗PSMD8抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-514053 | |
| 抗GCLC抗体 | Elabscience | E-AB-52359 | |
| 抗组织蛋白酶Z抗体 | Elabscience | E-AB-13977 | |
| 抗凝溶胶蛋白抗体 | Genetex | GTX114078 | |
| 抗磷酸化Creb1抗体 | Cell Signaling Technology | 9196s | |
| 抗Creb1抗体 | Cell Signaling Technology | 9197s | |
| 抗GSTO1抗体 | Genetex | GTX105655 | |
| 抗磷酸化IKKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2078 | |
| 抗磷酸化IkBα抗体 | Cell Signaling Technology | 2859 | |
| 抗IkBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4814 | |
| 抗IKKα抗体 | Cell Signaling Technology | 2682 | |
| 抗NF-kB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 抗组蛋白H3抗体 | Abcam | ab18521 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Sigma Aldrich | T8203 | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| High Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| EvaGreen qPCR预混液 | Solis BioDyne | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 原代星形胶质细胞培养 | 小鼠品系（hSOD1(G93A)和hSOD1(WT)）、新生小鼠日龄、培养时间、培养基配方、细胞纯度 阅读提示：Methods 4.2 |
| 分泌代谢组学分析 | 样本量（n=15）、细胞培养时间、样本前处理、色谱和质谱条件、数据过滤标准 阅读提示：Methods 4.3, 4.4 |
| 蛋白质组学分析 | 生物学重复数、TMT标记、质谱参数、蛋白鉴定和定量标准 阅读提示：Methods 4.6, 4.7, 4.8 |
| Western blot验证 | 抗体信息、蛋白质上样量、内参选择、统计方法 阅读提示：Methods 4.10 |
| 转录因子活性验证 | 细胞裂解和核质分离方法、抗体信息、qRT-PCR参数 阅读提示：Methods 4.9, 4.12, 4.13 |