化合物合成与初步活性筛选
设计并合成Oma衍生物，筛选具有Nrf2激活活性的候选化合物。
基于Oma结构进行修饰，合成Cpd.51，利用ARE-荧光素酶报告基因和Nrf2荧光传感器系统评估其Nrf2激活活性。
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发现一种新型Nrf2激活剂，通过调节DHRS3-Nrf2相互作用在缺血性卒中后调节神经元线粒体功能
Discovery of a novel Nrf2 activator that modulates mitochondrial function in neurons by regulating DHRS3-Nrf2 interaction after ischemic stroke.
实验完整度
高包含体外细胞模型、原代神经元、大鼠tMCAO模型、分子对接、SPR、CETSA、Co-IP、ChIP、GST pull-down、RNA-seq及毒理学评价等多层级验证。
主要模型
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞系 大鼠原代皮层神经元 大鼠tMCAO局灶性脑缺血模型 Hek-293T细胞（用于机制研究）
重点核对
Cpd.51给药剂量：3 mg/kg或5 mg/kg，静脉注射 OGD/R模型：葡萄糖缺乏条件下培养2.5小时，复氧24小时 Nrf2敲低：AAV-shNrf2注射侧脑室或转导细胞 Cpd.51处理浓度：100 nM（体外） 检测指标：梗死体积、mNSS评分、线粒体功能（JC-1、Calcein-AM、ATP）、氧化应激（GSH、MDA）
摘要
理由：鉴于Nrf2通路在细胞对应激的适应性中的关键作用，靶向Nrf2的小分子激活是急性缺血性卒中（AIS）的一种有前景的治疗策略。然而，现有Nrf2激活剂的临床转化受到不良效应（如肝损伤）的阻碍，且目前尚无药物被批准用于AIS。因此，我们旨在开发一种新型Nrf2激活剂，特异性激活神经元Nrf2，同时减轻不良效应，以期为AIS提供先导化合物。方法：我们通过多项体内和体外实验验证了新型Nrf2激活剂Cpd.51的抗AIS效应和线粒体保护功能。涉及表面等离子体共振、细胞热位移分析、免疫共沉淀、染色质免疫沉淀、GST pull-down和RNA测序的机制研究用于确定Cpd.51如何激活Nrf2。进行了比较毒理学评价以证明其优于母体化合物（Omaveloxolone）的安全性。结果：Cpd.51表现出良好的血脑屏障通透性、改善的安全性、增强的线粒体功能保护以及通过特异性激活神经元Nrf2而显著的神经保护作用。机制上，Cpd.51与Keap1的BTB结构域中的Cys151和Gly148相互作用，抑制Nrf2降解，从而抑制其下游靶标DHRS3（短链脱氢酶/还原酶家族成员）的转录。此外，Cpd.51通过破坏Nrf2与DHRS3之间的蛋白质-蛋白质相互作用发挥额外的Nrf2激活活性。结论：我们的工作确定了Cpd.51是一种新型且安全的Nrf2激活剂，并揭示了涉及Nrf2-DHRS3相互作用的独特反馈机制，为AIS提供了新的治疗途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种新型Nrf2激活剂，在缺血性卒中中特异性激活神经元Nrf2并减轻不良反应，并探索其作用机制。
- 核心机制
- Cpd.51通过结合Keap1的Cys151和Gly148，抑制Nrf2降解，并破坏Nrf2-DHRS3蛋白-蛋白相互作用，增强Nrf2活性；Nrf2直接结合DHRS3启动子抑制其转录，形成反馈机制。
- 主要证据
- 体外OGD/R模型和体内tMCAO模型显示Cpd.51改善神经功能和线粒体损伤；SPR、CETSA、Co-IP、GST pull-down证实Cpd.51与Keap1和DHRS3结合；Nrf2敲低反转其保护作用。
- 研究意义
- 揭示了Nrf2-DHRS3相互作用作为AIS的新调控轴，Cpd.51可能成为AIS的候选药物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外神经保护作用验证
验证Cpd.51在OGD/R损伤模型中对神经元细胞的保护作用。
使用SH-SY5Y细胞和原代皮层神经元，建立OGD/R模型，CCK-8检测细胞活力，评估Cpd.51的细胞毒性、EC50及保护作用。
体内药效评价
评估Cpd.51在tMCAO模型中的神经保护作用。
建立大鼠tMCAO模型，术后立即或延迟静脉注射Cpd.51，通过TTC染色评估梗死体积，mNSS评分评估神经功能。
线粒体功能检测
评估Cpd.51对缺血性损伤后线粒体功能的修复作用。
采用透射电镜观察线粒体形态，JC-1检测膜电位，Calcein-AM检测MPTP，DCFH-DA检测ROS，ATP检测试剂盒测定ATP水平，Western blot和qPCR检测PINK1、TFAM表达。
机制研究：Cpd.51与Keap1的结合
确定Cpd.51与Keap1的结合位点和亲和力。
利用SPR测定Cpd.51与Keap1及其截短体的结合亲和力，分子对接预测结合模式，CETSA和DARTS验证细胞内结合，并利用Keap1突变体（C151A、G148A）通过CETSA验证关键残基。
机制研究：DHRS3的鉴定与验证
鉴定Cpd.51调控的潜在新靶点DHRS3，并验证其在神经保护和线粒体功能中的作用。
利用RNA-seq筛选Cpd.51调控的基因，鉴定出DHRS3；通过Western blot、免疫荧光、线粒体分离验证DHRS3表达和定位；过表达DHRS3检测其对Cpd.51保护功能的影响；使用AAV-shDHRS3敲低验证其对tMCAO损伤的影响。
机制研究：Nrf2-DHRS3相互作用
阐明Cpd.51如何通过DHRS3影响Nrf2活性。
使用AlphaFold 3预测Nrf2-DHRS3相互作用界面，Co-IP和GST pull-down验证直接结合，构建DHRS3截短体确定结合区域，分子对接和SPR测试Cpd.51与DHRS3的结合，分子动力学模拟研究结合稳定性。
机制研究：Nrf2对DHRS3的转录调控
验证Nrf2是否直接抑制DHRS3转录。
通过UCSC和JASPAR数据库预测Nrf2结合位点，ChIP-PCR验证Nrf2与DHRS3启动子结合，并在Nrf2敲低细胞和动物中检测DHRS3表达。
安全性评价
比较Cpd.51和Oma的急性和长期毒性。
急性毒性实验：大鼠连续7天静脉注射10 mg/kg Cpd.51或Oma，检测肝功能指标（GPT、GOT）、肾功能指标（CRE、BUN）。长期毒性实验：连续28天灌胃，检测脏器指数、组织分布、血浆标志物。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | MEM培养基 | Gibco | 12492013 |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965092 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| MEM完全培养基 | Sunncell | SNLM-552 | |
| DMEM完全培养基 | Procell | CM-0620 | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | C0039 |
| 原代细胞培养 | 0.25%胰蛋白酶消化液 | ABclonal | BR00083 |
| 多聚D-赖氨酸 | Solarbio | P2100 | |
| Neurobasal培养基 | Gibco | 10888022 | |
| Glutamax添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| B27添加剂 | Gibco | 17504044 | |
| 阿糖胞苷 | Sigma | V900339 | |
| ATP检测 | ATP检测液 | PerkinElmer | 0RT0769 |
| ATP检测试剂盒 | Beyotime | S0027 | |
| 报告基因实验 | ARE-荧光素酶报告质粒 | Yeasen | 11548ES03 |
| 萤火虫荧光素酶检测试剂盒 | Yeasen | 11412ES81 | |
| 转染 | Opti-MEM培养基 | Gibco | 51985034 |
| PEI 40000转染试剂 | Yeasen | 40816ES01 | |
| 动物实验 | MCAO线栓 | RWD Life Science | -- |
| TTC染色 | 2,3,5-三苯基氯化四氮唑 | TCI | 298-96-4 |
| 生化指标检测 | MDA检测试剂盒 | Beyotime | S0131M |
| GSH检测试剂盒 | Beyotime | S0053 | |
| 肝功能检测 | 谷丙转氨酶检测试剂盒 | mlbio | ml092635 |
| 谷草转氨酶检测试剂盒 | mlbio | ml092714 | |
| 肾功能检测 | 肌酐检测试剂盒 | mlbio | M12C4L |
| 血尿素氮检测试剂盒 | mlbio | ml076479 | |
| SPR | Biacore T200 | Cytiva | -- |
| LC-MS/MS | 岛津色谱系统 | Shimadzu | -- |
| AB Sciex三重四极杆4500质谱仪 | SCIEX | -- | |
| ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱 | Waters | -- | |
| 代谢物鉴定 | Waters G2-XS Q-Tof UPLC-MS系统 | Waters | -- |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| 线粒体蛋白提取试剂盒 | Beyotime | C3601 | |
| PVDF膜 | Thermo Scientific | 88520 | |
| 免疫荧光 | ROS检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| JC-1线粒体膜电位检测试剂盒 | Beyotime | C2003S | |
| Calcein-AM检测 | Beyotime | Y237214-1mg | |
| DAPI | Beyotime | C1006-200mL | |
| RT-qPCR | SPARKeasy超纯总RNA快速提取试剂盒 | Sparkjade | AC0103 |
| cDNA合成试剂盒 | Sparkjade | AG0302-B | |
| SYBR Green试剂 | Sparkjade | AH0104-C | |
| 质粒转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000075 |
| P3000试剂 | Invitrogen | -- | |
| DARTS | 链霉蛋白酶 | Merck | 10165921001 |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | Thermo Scientific | 88804 |
| GST pull-down | GST-Nrf2蛋白 | Ybio | YB710012 |
| GST蛋白 | Proteintech | Ag0040 | |
| GST树脂 | Elabscience Biotechnology | EA-IP-K008 | |
| DHRS3蛋白 | Ybio | YB765100 | |
| ChIP | 染色质免疫沉淀试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| 动物实验 | AAV-shNrf2 | Genechem Technology | -- |
| AAV-shCon | Genechem Technology | -- | |
| AAV-DHRS3 | Genechem Technology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and drug administration in vitro |
| OGD/R模型 | OGD持续时间、无糖培养基、复氧时间 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and drug administration in vitro |
| 药物处理 | Cpd.51浓度、处理时间（12小时预处理）、给药方式 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture and drug administration in vitro |
| 动物模型 | 大鼠品系、体重、麻醉方法、缺血时间（90分钟）、线栓插入 阅读提示：Materials and Methods: Animal model |
| 药物给药 | Cpd.51剂量（3或5 mg/kg）、溶剂（10% DMSO, 10% Solutol HS-15, 80% saline）、给药途径（静脉注射） 阅读提示：Materials and Methods: Animal |
| Nrf2敲低 | AAV-shNrf2注射体积、滴度、注射坐标 阅读提示：Materials and Methods: Animal model |
| 线粒体功能检测 | JC-1、Calcein-AM、ROS检测方法及参数 阅读提示：Materials and Methods: Immunofluorescence and confocal analysis |
| 机制研究 | SPR固定蛋白、Cpd.51浓度、CETSA加热温度、Co-IP抗体、GST pull-down条件 阅读提示：Materials and Methods: Surface plasmon resonance (SPR), Cellular thermal shift assay (CETSA), Co-IP and GST pull down |