筛选脂肪代谢相关预后基因
鉴定在宫颈癌中异常表达且具有预后价值的脂肪酸代谢相关基因。
从GEPIA2获取DEGs，与KEGG脂肪酸代谢基因集交叉筛选，利用Kaplan-Meier Plotter分析预后，TIMER2.0分析免疫浸润相关性。
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SREBF2通过增加ACAT2增强宫颈癌脂质代谢并抑制抗肿瘤免疫应答
SREBF2 enhances lipid metabolism and represses anti-tumor immune responses in cervical cancer by increasing ACAT2.
实验完整度
高体外细胞实验、体内小鼠模型、临床样本分析、机制研究（Co-IP、ChIP、双荧光素酶报告基因等），涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
宫颈癌细胞系（C-33A、HeLa等） 小鼠宫颈癌U14细胞移植瘤模型（C57BL/6小鼠） 宫颈癌患者肿瘤及癌旁组织样本 外周血单个核细胞（PBMC）来源的NK细胞和CD8+ T细胞
重点核对
ACAT2在CC组织和细胞中的表达是否升高（IHC、Western blot、RT-qPCR） 敲低ACAT2对CC细胞增殖和胆固醇含量的影响（CCK8、克隆形成、胆固醇检测） ACAT2表达与NK和CD8+ T细胞浸润的负相关关系（TIMER2.0、免疫荧光） SREBF2对ACAT2启动子的直接结合和转录激活（ChIP、双荧光素酶报告基因） PRKN对SREBF2蛋白的泛素化降解作用（Co-IP、CHX实验）
摘要
乙酰辅酶A乙酰转移酶（ACATs）是膜结合酶，在各种组织中调节细胞胆固醇稳态中发挥关键作用。在此，我们旨在评估ACAT2对宫颈癌（CC）脂质积累的影响。ACAT2在CC中表达增强，并与CC的免疫逃逸和临床进展密切相关。在CC细胞中敲低ACAT2表达可抑制CC生长，改善携带肿瘤的C57BL/6小鼠的生存，并增强自然杀伤细胞和CD8+ T细胞的抗肿瘤免疫应答。固醇调节元件结合转录因子2（SREBF2）的蛋白表达在CC中升高，并介导ACAT2的转录激活。E3泛素蛋白连接酶parkin（PRKN）在CC中表达减弱，导致SREBF2泛素化水平降低和SREBF2稳定性增强。PRKN通过抑制SREBF2/ACAT2抑制CC中胆固醇积累，激活线粒体自噬，并改善免疫逃逸。SREBF2的过表达以ACAT2依赖的方式阻断PRKN的抗肿瘤作用。本研究强调了ACAT2在CC进展中的关键功能，并描绘了其作为治疗潜在策略的可能性。该方法涉及战略性阻断与ACAT2相关的代谢途径。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ACAT2在宫颈癌脂质代谢和免疫逃逸中的作用及其上游调控机制是什么？
- 核心机制
- PRKN缺失导致SREBF2降解失败，SREBF2作为转录因子激活ACAT2表达，促进胆固醇积累和抑制线粒体自噬，从而促进免疫逃逸。
- 主要证据
- 临床样本中ACAT2高表达与不良预后及免疫细胞浸润减少相关；体外敲低ACAT2抑制增殖并增强免疫细胞杀伤；PRKN过表达降低SREBF2蛋白并激活线粒体自噬；体内实验证实PRKN过表达抑制肿瘤生长并改善生存，SREBF2以ACAT2依赖方式逆转该效应。
- 研究意义
- 本研究揭示了ACAT2在CC进展中的关键作用，并提出了靶向ACAT2代谢通路作为CC免疫治疗的潜在策略，可能增强免疫检查点阻断或过继性NK细胞疗法的疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ACAT2在临床样本中的表达和临床意义
评估ACAT2在宫颈癌组织中的表达水平及其与临床病理特征和免疫浸润的关系。
通过免疫组织化学检测47例CC及癌旁组织中ACAT2表达，分析其与临床参数（淋巴结转移、FIGO分期）的关系，并检测胆固醇合成蛋白DHCR7/MSMO1表达及CD8+ T细胞和NK细胞浸润。
体外敲低ACAT2对CC细胞功能的影响
验证ACAT2在宫颈癌细胞增殖和免疫逃逸中的作用。
在C-33A和HeLa细胞中通过慢病毒感染敲低ACAT2，检测胆固醇水平、增殖能力（CCK8、克隆形成）以及与NK/CD8+ T细胞共培养后的杀伤效果和细胞因子释放。
体内验证ACAT2敲低对肿瘤生长和免疫的影响
评估ACAT2敲低对小鼠移植瘤生长和肿瘤免疫微环境的影响。
将稳定敲低ACAT2的U14细胞皮下注射至C57BL/6小鼠，监测肿瘤体积和重量，检测胆固醇含量、免疫细胞浸润和生存期。
鉴定SREBF2作为ACAT2的转录因子
确定调控ACAT2表达的上游转录因子及其结合位点。
利用TFTF和JASPAR预测ACAT2上游转录因子，通过双荧光素酶报告基因和ChIP验证SREBF2与ACAT2启动子的结合。
探索PRKN对SREBF2蛋白稳定性的调控
研究E3泛素连接酶PRKN对SREBF2蛋白泛素化降解的作用。
通过Co-IP检测SREBF2的泛素化水平，筛选E3连接酶，验证PRKN与SREBF2的相互作用及其对SREBF2蛋白稳定性的影响。
验证PRKN通过SREBF2/ACAT2轴调节脂质代谢和线粒体自噬
阐明PRKN对脂质代谢和线粒体自噬的影响及其依赖SREBF2/ACAT2的机制。
过表达PRKN或联合SREBF2/ACAT2干预，检测胆固醇含量、线粒体自噬相关蛋白（TOM20、TIM23、P62、LC3）及mKeima-Red-Mito-7质粒观察自噬溶酶体形成。
检测PRKN对CC细胞增殖和免疫逃逸的影响
评估PRKN过表达对肿瘤细胞增殖以及NK/CD8+ T细胞杀伤的影响，并验证SREBF2/ACAT2的介导作用。
在共培养体系中检测CC细胞死亡和IFN-γ/GZMB释放，并检测TGF-β1分泌和PD-L1表达。
体内验证PRKN阻断SREBF2/ACAT2信号抑制肿瘤进展
在动物模型中验证PRKN过表达对肿瘤生长和免疫微环境的影响，并确认依赖SREBF2/ACAT2。
构建稳定表达PRKN和/或SREBF2及敲低ACAT2的U14细胞，皮下注射至小鼠，监测肿瘤生长、免疫细胞浸润和生存。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | 抗ACAT2抗体 | ProteinTech Group | 14755-1-AP |
| 抗DHCR7抗体 | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA5-48204 | |
| 抗MSMO1抗体 | Thermo Fisher Scientific Inc. | PA5-48651 | |
| 抗SREBF2抗体 | ABclonal | A13049 | |
| 抗PRKN抗体 | ProteinTech Group | 14060-1-AP | |
| 二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG） | Beyotime | A0208 | |
| DAB显色液 | Sigma-Aldrich | D8001 | |
| 免疫荧光 | 抗GZMB抗体 | ProteinTech Group | 13588-1-AP |
| 抗CD8A抗体 | ProteinTech Group | 66868-1-Ig | |
| 抗CD56抗体 | ProteinTech Group | 60238-1-Ig | |
| Cy3标记的山羊抗兔IgG | Beyotime | A0516 | |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG | Beyotime | A0568 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875085 |
| MEM培养基（含NEAA） | Procell | PM150410 | |
| McCoy's 5A培养基 | Procell | PM150710 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 11965084 | |
| 胎牛血清 | Gibco | A5256901 | |
| 青霉素-链霉素 | Procell | PB180120 | |
| 胆固醇 | MedChemExpress | HY-N0322 | |
| 蛋白质降解实验 | MG132 | MedChemExpress | HY-13259 |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific Inc. | L3000015 |
| mKeima-Red-Mito-7质粒 | Addgene | 56018 | |
| RNA提取 | TRIeasy总RNA提取试剂 | Yeasen | 10606ES60 |
| RT-qPCR | Hifair IV逆转录酶 | Yeasen | 11112ES92 |
| Hieff UNICON ColorGPS qPCR SYBR Green预混液 | Yeasen | 11189ES08 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| Western blot | 抗泛素抗体 | ProteinTech Group | 10201-2-AP |
| 抗TOM20抗体 | ProteinTech Group | 11802-1-AP | |
| 抗TIM23抗体 | ProteinTech Group | 11123-1-AP | |
| 抗P62抗体 | ProteinTech Group | 31403-1-AP | |
| 抗LC3抗体 | ProteinTech Group | 14600-1-AP | |
| 抗PD-L1抗体 | ABclonal | A1645 | |
| 抗TGF-β1抗体 | ABclonal | A25313 | |
| 抗Vinculin抗体 | ProteinTech Group | 26520-1-AP | |
| 胆固醇检测 | 胆固醇/胆固醇酯检测试剂盒 | Abcam | ab65359 |
| 细胞增殖检测 | CCK8试剂 | Beyotime | C0038 |
| 细胞增殖检测（克隆形成） | 结晶紫 | Beyotime | C0121 |
| 免疫细胞分离 | Ficoll-Paque PLUS淋巴细胞分离液 | Cytiva | 17144003 |
| Dynabeads人NK细胞未接触分离试剂盒 | Invitrogen | 11349D | |
| Dynabeads人CD8 T细胞未接触分离试剂盒 | Invitrogen | 11348D | |
| 免疫细胞培养 | CTS NK-Xpander培养基 | Gibco | A5019001 |
| 人AB型血清 | Sigma-Aldrich | H4522 | |
| 重组人IL-2 | Roche Diagnostics | HIL2-RO | |
| CTS OpTmizer T细胞扩增无血清培养基 | Gibco | A1048501 | |
| Dynabeads人T细胞激活磁珠CD3/CD28 | Gibco | 11161D | |
| 细胞杀伤实验 | 活/死细胞介导的细胞毒性检测试剂盒 | Invitrogen | L7010 |
| ELISA | 人IFN-γ ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H0108 |
| 人GZMB ELISA试剂盒 | Elabscience | E-EL-H1617 | |
| 人TGF-β1 ELISA试剂盒 | Beyotime | PT880 | |
| 流式细胞术 | BeyoFC细胞染色缓冲液 | Beyotime | C1711 |
| BeyoFC Fc受体阻断液 | Beyotime | C1755 | |
| FITC标记的抗CD3抗体 | ProteinTech | FITC-65077 | |
| PE标记的抗NK1.1抗体 | ProteinTech | PE-65138 | |
| APC标记的抗CD8A抗体 | ProteinTech | APC-65069 | |
| PE-CY7标记的抗GZMB抗体 | Thermo Fisher Scientific Inc. | 25-8898-82 | |
| BeyoFC细胞透化洗涤缓冲液 | Beyotime | C1717 | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL4.10[luc2]载体 | Promega Corporation | E6651 |
| 对照海肾荧光素酶载体 | Promega Corporation | E6911 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corporation | E1910 | |
| ChIP | SimpleChIP Plus超声ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technologies | 56383 |
| ChIP级SREBF2抗体 | Novus Biological Inc. | NBP1-54446 | |
| 小鼠IgG | Novus Biological Inc. | NBP1-43319 | |
| Co-IP | Protein G-琼脂糖 | Sangon | -- |
| 动物实验 | 基质胶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 样本量（47例），患者年龄范围（36-72岁），分组依据（ACAT2 IOD均值12008318），免疫细胞浸润检测方法 阅读提示：Methods中的Patients and tissue samples和Immunohistochemistry |
| 细胞培养和处理 | 细胞系（C-33A、HeLa、U14），培养基和添加剂，胆固醇处理浓度（100 μM）和时间（24 h），MG132（10 μM，1 h），CHX（1 μM） 阅读提示：Methods中的Cell lines and cell culture |
| 基因敲低和过表达 | shRNA靶序列，MOI（5），转染试剂（Lipofectamine 3000），转染时间（48 h） 阅读提示：Methods中的Plasmids and generation of stable cell lines |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6，6周龄，雌性），细胞数（1×10^6），注射方式（皮下），肿瘤体积测量频率（每2天），观察时间（21天），生存观察（60天） 阅读提示：Methods中的In vivo tumor model |
| 免疫细胞分离和共培养 | 健康志愿者PBMC分离方法，NK和CD8+ T细胞分离试剂盒，共培养比例（E:T=3:1），共培养时间（6小时） 阅读提示：Methods中的Immune cell isolation and culture和Immune cell-mediated tumor killing assay |
| 蛋白表达检测 | 抗体来源和稀释比，蛋白上样量，内参蛋白（Vinculin），灰度分析软件（ImageJ） 阅读提示：Methods中的Protein extraction and western blot analysis |