表达相关性分析
验证PD-L1与αvβ3在多种人类癌症中的表达相关性，并分析αvβ3表达与免疫治疗反应的关系。
使用Xiantao在线工具分析TCGA数据中CD274、ITGAV、ITGB3基因表达；用TISIDB数据库分析αvβ3表达与免疫治疗反应的相关性；并用免疫组化验证蛋白水平表达。
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靶向αvβ3和PD-L1的双功能抗体为实体瘤治疗提供了有前景的策略
Dual function antibody targeting αvβ3 and PD-L1 provide a promising strategy for solid tumor therapy.
实验完整度
高包含数据库分析、体外细胞实验（SPR、流式、迁移、侵袭、管形成、凋亡、免疫印迹）和多种体内小鼠模型（MC38-hPD-L1、B16/F10、H_αvβ3 A375、MDA-MB-231）及药代/毒理研究，功能验证和机制验证齐全。
主要模型
MC38-hPD-L1移植瘤模型（C57BL/6N小鼠） B16/F10移植瘤模型（C57BL/6N小鼠） H_αvβ3 A375异种移植瘤模型（B-NDG B2m KO小鼠，含人PBMC） MDA-MB-231异种移植瘤模型（B-NDG B2m KO小鼠，含人PBMC）
重点核对
B1451与PD-L1和αvβ3的结合亲和力（KD分别为31.63 nM和15.45 μM） B1451对PD-1/PD-L1通路的阻断活性（通过NFAT报告基因检测） B1451对αvβ3/玻连蛋白通路的阻断活性（ELISA） B1451在MC38-hPD-L1和B16/F10模型中的剂量依赖性抗肿瘤效果（2.5-10 mg/kg，4-12 mg/kg） B1451对肿瘤微环境中CD8+ T细胞浸润和CD31+微血管密度的影响
摘要
背景：PD-1/PD-L1轴的抑制在癌症免疫治疗中取得了显著进展，改善了多种癌症患者的预后。然而，在许多情况下，这些单一疗法的临床疗效仍然有限。整合素αvβ3已被确定为PD-L1表达的阳性调节因子，并且是癌症免疫逃逸的关键因素。为了解决这一问题，我们开发了一种双功能抗体B1451，可同时识别PD-L1和αvβ3，并在体外和体内的临床前模型中评估了其抗肿瘤疗效。方法：我们首先使用TISIDB数据库分析了PD-L1与αvβ3表达之间的相关性，以及αvβ3在调节免疫治疗敏感性中的作用。随后，我们通过使用(G4S)×3连接子将整合素αvβ3结合肽偶联到抗PD-L1单克隆抗体阿替利珠单抗重链的C末端，设计并构建了一种双功能PD-L1×αvβ3抗体(B1451)。然后在体外和体内的临床前模型中评估了B1451的抗肿瘤疗效。结果：我们的研究结果表明，在多种人类实体瘤中，PD-L1与αvβ3的基因表达之间存在显著的正相关性。此外，高αvβ3表达似乎影响免疫治疗的敏感性。双功能抗体B1451能够识别人类PD-L1和αvβ3抗原，有效阻断PD-1/PD-L1和玻连蛋白/αvβ3通路。B1451在体外抑制肿瘤细胞迁移、粘附和血管生成，并在体内表现出优于单一疗法的抗肿瘤活性。结论：同时靶向αvβ3和PD-L1的双功能抗体具有逆转免疫逃逸和发挥协同抗肿瘤作用的潜力，为实体瘤的治疗提供了一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 同时靶向αvβ3和PD-L1的双功能抗体B1451能否在实体瘤中发挥协同抗肿瘤作用，从而克服单一PD-1/PD-L1阻断疗法疗效有限的问题？
- 核心机制
- B1451通过同时阻断PD-1/PD-L1和αvβ3/玻连蛋白通路，上调肿瘤组织中细胞毒性CD8+ T细胞的浸润，降低PD-L1表达以缓解免疫逃逸，并通过下调AKT磷酸化和MMP9表达抑制血管生成和肿瘤转移。
- 主要证据
- 体外实验和多种小鼠移植瘤模型（MC38-hPD-L1、B16/F10、H_αvβ3 A375、MDA-MB-231）显示，B1451在抑制肿瘤生长方面优于单一抗PD-L1或HM-3治疗；免疫荧光和免疫组化分析显示CD8+ T细胞浸润增加和CD31+微血管密度降低。
- 研究意义
- 本研究为开发靶向PD-L1和αvβ3的新型双特异性抗体疗法提供了临床前依据，为未来实体瘤免疫治疗的联合治疗策略提供了新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
B1451双功能抗体的构建与结合特性鉴定
构建同时靶向PD-L1和αvβ3的双功能抗体，并验证其结合特异性和亲和力。
通过(G4S)×3连接子将HM-3肽偶联至阿替利珠单抗重链C末端构建B1451。利用SPR检测对PD-L1和αvβ3的亲和力，通过流式细胞术检测对多种细胞系的结合特异性。
体外功能评价
验证B1451对肿瘤细胞迁移、侵袭、血管生成和凋亡的影响。
通过Transwell实验检测H_αvβ3 A375细胞迁移和侵袭能力，用HUVEC细胞管形成实验评估血管生成，用Annexin V-FITC/PI染色检测细胞凋亡，并用免疫印迹检测AKT磷酸化和MMP9蛋白表达水平。
体内剂量效应和药效评估
评估B1451在不同小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性及其剂量依赖性。
在MC38-hPD-L1、B16/F10和H22移植瘤模型中，比较B1451与单一疗法（抗PD-L1、HM-3）及联合疗法的抗肿瘤效果，并测试不同剂量B1451的疗效。
肿瘤微环境分析
分析B1451治疗后肿瘤微环境中免疫细胞浸润和血管生成的变化。
利用多重免疫荧光检测MC38-hPD-L1肿瘤中CD4+和CD8+ T细胞浸润，免疫组化检测CD31+血管密度。
人源化小鼠模型中的药效验证
在含有免疫细胞的人源化小鼠模型中验证B1451的肿瘤消退效果。
在B-NDG B2m KO小鼠中建立H_αvβ3 A375和MDA-MB-231异种移植瘤模型，并注入人PBMC，评估B1451的肿瘤生长抑制效果和免疫细胞浸润。
药代动力学和毒理学研究
评估B1451的药代动力学特性和重复给药的耐受性。
在C57BL/6N小鼠中单次静脉注射10或100 mg/kg B1451后，用ELISA检测血药浓度，分析其药代动力学参数；进行四周重复给药毒性实验，评估临床体征、体重、摄食量、器官重量和临床生化指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 表面等离子体共振分析 | Biacore T200 | GE healthcare | -- |
| CM5传感芯片 | Cytiva | -- | |
| 人抗体捕获试剂盒 | Cytiva | BR100839 | |
| 细胞培养 | U251细胞 | Pricella | -- |
| SU.86.86细胞 | Pricella | -- | |
| ACHN细胞 | Pricella | -- | |
| MDA-MB-468细胞 | Cobioer | -- | |
| MDA-MB-231细胞 | Cobioer | -- | |
| H22细胞 | Cobioer | -- | |
| B16/F10细胞 | Cobioer | -- | |
| MC38-hPD-L1细胞 | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | -- | |
| H_αvβ3 A375细胞 | Genomeditech | -- | |
| Jurkat-PD-1-NFAT报告细胞 | National Institutes for Food and Drug Control | -- | |
| CHO-PD-L1-CD3L细胞 | National Institutes for Food and Drug Control | -- | |
| 人外周血单个核细胞 | ORiCELLS | -- | |
| 流式细胞术 | APC抗人CD51/61抗体 | Biolegend | 304416 |
| NovoCyte Quanteon流式细胞仪 | Agilent | -- | |
| APC抗人CD45抗体 | Biolegend | 982304 | |
| APC_Fire 750抗人CD8a抗体 | Biolegend | 344746 | |
| Pacific Blue抗人CD4抗体 | Biolegend | 317424 | |
| 细胞结合实验 | PE标记的抗人IgG Fc抗体 | Biolegend | 409304 |
| PD-1/PD-L1阻断实验 | Bio-Lite荧光素酶检测系统试剂 | Vazyme | DD1201-02 |
| Infinite 200 PRO酶标仪 | TECAN | -- | |
| αvβ3/玻连蛋白阻断实验 | 人玻连蛋白 | sigma | SRP3186-250UG |
| ITGAV&ITGB3异二聚体蛋白 | Acro | IT3-H52E3 | |
| 小鼠CD51/CD61抗体 | R&D | 555504 | |
| 抗小鼠IgG（全分子）过氧化物酶抗体 | Sigma | A5906 | |
| 细胞迁移实验 | 24孔Transwell培养小室（8.0 μm孔径） | Corning | 3422 |
| 细胞侵袭实验 | Matrigel预包被的Transwell小室 | Corning | 354234 |
| 管形成实验 | Matrigel基质胶 | Corning | 354234 |
| 细胞凋亡实验 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Vazyme | A211 |
| 免疫印迹实验 | 细胞裂解液 | CST | 9803 |
| 兔抗MMP-9多克隆抗体 | Proteintech | 10375-2-AP | |
| 小鼠抗AKT单克隆抗体 | Proteintech | 60203-2-Ig | |
| 兔抗磷酸化AKT (Ser473)抗体 | CST | 4060S | |
| 小鼠抗GAPDH单克隆抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 抗兔IgG HRP连接抗体 | CST | 7074 | |
| 抗小鼠IgG HRP连接抗体 | CST | 7076 | |
| 免疫组织化学分析 | 兔抗PD-L1抗体 | Abcam | ab205921 |
| 小鼠抗整合素αVβ3抗体 | Abcam | ab7166 | |
| Leica RM2255轮转式切片机 | Leica | -- | |
| Leica HT1220烤片机 | Leica | -- | |
| 兔抗CD31抗体 | CST | 77699 | |
| Leica DFC7000T CCD | Leica | -- | |
| 多重免疫荧光分析 | 抗CD4抗体 | CST | 25229 |
| 抗CD8抗体 | CST | 98941 | |
| 抗PD-L1抗体 | CST | 13684 | |
| 抗兔HRP二抗 | CST | 8114 | |
| Alexa Fluor 555 (CD4) | Invitrogen | B40955 | |
| Alexa Fluor 594 (CD8) | Invitrogen | B40957 | |
| Alexa Fluor 488 (PD-L1) | Invitrogen | B40953 | |
| prolong gold抗淬灭封片剂 | CST | 9071 | |
| 药代动力学研究 | 人PD-L1蛋白（hFc标签） | ACRO | PD-1-H5258 |
| SC1483A定制单克隆抗体 | GenScript | C8499DC070-1 | |
| HRP标记的亲和纯化山羊抗小鼠IgG (H+L) | Proteintech | SA00001-1 | |
| 细胞结合实验 | 96孔V底板 | Corning | 3897 |
| PD-1/PD-L1阻断实验 | 96孔白板 | Corning | 3610 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源和培养条件（如MC38-hPD-L1、H_αvβ3 A375、MDA-MB-231等），培养基和O2/CO2浓度 阅读提示：Materials and methods - Cell lines and cell culture |
| SPR结合亲和力 | B1451捕获量约35 RU，PD-L1浓度范围0.78125-50 nM，αvβ3浓度范围12.5-400 nM，结合时间分别为1500秒和120秒，再生液为10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5 阅读提示：Materials and methods - Binding affinity detection by surface plasmon resonance |
| PD-1/PD-L1阻断实验 | CHO-PD-L1-CD3L细胞5×10^4/孔，Jurkat效应细胞1×10^5/孔，共培养6小时，孵育后在37°C CO2培养箱中进行 阅读提示：Materials and methods - PD-1/PD-L1 blockade assay |
| αvβ3/玻连蛋白阻断实验 | 玻连蛋白包被浓度2 μg/mL，ITGAV&ITGB3蛋白2.5 μg/mL，B1451浓度范围1.5625-800 μg/mL 阅读提示：Materials and methods - αvβ3/vitronectin blockade assay |
| 细胞迁移和侵袭 | 迁移：1×10^4细胞/孔，2% FBS，培养14小时；侵袭：8×10^3细胞/孔，1% FBS，10% FBS趋化，培养24小时；B1451浓度范围10-160 μg/mL 阅读提示：Materials and methods - Cell migration assay, Cell invasion assay |
| 管形成实验 | HUVEC细胞6×10^5细胞/孔，培养18小时，使用Matrigel包被 阅读提示：Materials and methods - Tube formation |
| 凋亡和免疫印迹实验 | 凋亡实验：B1451处理20或100 μg/mL 24小时；免疫印迹：B1451处理10, 40, 160 μg/mL 24小时 阅读提示：Materials and methods - Cell apoptosis assay, Immunoblot assay |
| 体内移植瘤模型 | MC38-hPD-L1模型：1×10^6细胞皮下注射，2.5, 5, 10 mg/kg，每周两次，共三周；B16/F10模型：5×10^5细胞皮下注射，4, 8, 12 mg/kg，每周两次，共三周；H22模型：需查补充材料 阅读提示：Materials and methods - Xenograft model, Figure 4A, 5A, Supplementary Figure S3 |
| 人源化小鼠模型 | B-NDG B2m KO小鼠，H_αvβ3 A375模型：1×10^6 PBMC和2×10^6肿瘤细胞混合注射，给药剂量5 mg/kg，第0, 3, 7天；MDA-MB-231模型：1×10^7肿瘤细胞，PBMC 5×10^6腹腔注射，给药剂量10 mg/kg，第0, 3, 6, 9, 13, 16, 20天 阅读提示：Materials and methods - Xenograft model, Figure 6A, 6D |
| 药代动力学和毒理学 | 单次静脉注射10或100 mg/kg B1451；重复给药毒性：10或100 mg/kg，每周一次，共四次，每组5/性别 阅读提示：Materials and methods - Pharmacokinetics study, Four-week repeated-dose toxicity study |