MRJPs提取与鉴定
获得MRJPs并验证其组成
从新鲜蜂王浆中通过离心、透析和冻干提取MRJPs,并用SDS-PAGE分析其蛋白条带。
Major Royal Jelly Proteins promote C2C12 myotubes differentiation by improving mitochondrial function.
体外细胞实验包括形态学染色、Western blot、RT-qPCR、荧光探针检测及药物干预,但缺乏动物或患者样本验证。
C2C12小鼠成肌细胞 C2C12肌管分化模型 地塞米松诱导的肌肉萎缩体外模型
MRJPs处理浓度:0、4、8、10 mg/mL 分化时间:6天 地塞米松浓度:10 μM,处理24小时 Mdivi-1浓度:20 μM,处理24小时 统计设计:每组3个重复,采用T检验和单因素方差分析(Tukey事后检验)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得MRJPs并验证其组成
从新鲜蜂王浆中通过离心、透析和冻干提取MRJPs,并用SDS-PAGE分析其蛋白条带。
建立肌管分化模型并评估MRJPs的最佳浓度
将C2C12成肌细胞在含不同浓度MRJPs的分化培养基中培养6天,诱导肌管形成。
验证MRJPs对肌管形成的促进作用
使用考马斯亮蓝染色和MyHC免疫荧光染色,观察肌管形态、密度和长度。
评估MRJPs对肌生成标志物的影响
通过RT-qPCR和Western blot检测MyoD、MyoG、Mrf4、MyHC IIb和MuRF-1的表达。
评估MRJPs对细胞凋亡和自噬的影响
通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达。
评估MRJPs对线粒体生物发生、动力学、自噬和功能的影响
通过Western blot检测PGC-1α、UCP-1、OPA1、MFN2、DRP1、PINK1、Parkin、BNIP3的表达;使用JC-1染色评估线粒体膜电位,DCFH-DA检测ROS水平。
验证MRJPs是否通过线粒体分裂和线粒体自噬促进分化,以及能否逆转地塞米松诱导的萎缩
将分化4天的肌管用MRJPs(8 mg/mL)、Dex(10 μM)和Mdivi-1(20 μM)单独或联合处理24小时,检测肌管形态、相关蛋白表达。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 提取MRJPs | 磷酸盐缓冲液(pH 7.0) | -- | -- |
| 透析膜 | Solarbio | YA1072 | |
| 冻干机(Alpha 1-4 LD plus) | Christ | Alpha | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 |
| SDS-PAGE | 考马斯亮蓝快速染色液 | Beyotime | P0017 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | BasalMedia | L310KJ |
| 胎牛血清 | Pricella | 1641010-50 | |
| 青霉素/链霉素 | Solarbio | P1400 | |
| 马血清 | Newzerum | ES-500 | |
| 药物处理 | 地塞米松 | MCE | HY-14648 |
| Mdivi-1 | MCE | HY-15886 | |
| RT-qPCR | 总RNA提取试剂盒 | TIANGEN | DP430 |
| HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper) | Vazyme | R323 | |
| Maxima SYBR Green qPCR预混液(2X) | Bimake | B21202 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| ECL化学发光底物试剂盒 | ABclonal | RM02867 | |
| 化学发光凝胶成像系统(Tanon 5200) | Tanon | 5200 | |
| ROS测量 | DCFH-DA荧光探针 | Beyotime | S0033S |
| JC-1测量 | JC-1染色液 | Beyotime | C2003S |
| 免疫荧光 | DAPI | Solarbio | C0065 |
| 抗荧光淬灭剂 | Solarbio | S2100 | |
| 显微镜成像 | 倒置荧光显微镜(IX73+DP80) | Olympus | IX73+DP80 |
| 激光共聚焦显微镜 | 激光共聚焦显微镜 | OLYMPUS | FV3000 |
| 荧光检测 | 多功能荧光酶标仪(Spark) | Tecan | Spark |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| MRJPs提取 | 蜂王浆与磷酸盐缓冲液的比例、离心转速和时间、透析时间、冻干时间 阅读提示:Materials and methods 2.1 |
| 细胞培养与分化 | 细胞接种密度、培养基成分、MRJPs浓度、分化时间、培养基更换频率 阅读提示:Materials and methods 2.4 |
| 药物处理模型 | Dex浓度、Mdivi-1浓度、处理时间、分化天数 阅读提示:Materials and methods 2.5, Results 3.8 |
| 分子检测 | RT-qPCR的内参基因、Western blot的抗体稀释度、蛋白定量方法 阅读提示:Materials and methods 2.7, 2.8 |
| 线粒体功能检测 | JC-1染色孵育时间、DCFH-DA浓度和孵育时间、荧光检测波长时间 阅读提示:Materials and methods 2.9, 2.10 |