主要蜂王浆蛋白通过改善线粒体功能促进C2C12肌管分化

Major Royal Jelly Proteins promote C2C12 myotubes differentiation by improving mitochondrial function.

作者信息Xin Zhang, Jinting Wei, Suchan Liao, Lingling Huang, Zhikun Bai, Yue Hu, Caiyan Yang, Bin Zhong, Yishen Gu, Biao Li, Jinhua Wang
PMID41561168
发布时间2026-01-05
DOI10.3389/fnut.2025.1636751

实验完整度

体外细胞实验包括形态学染色、Western blot、RT-qPCR、荧光探针检测及药物干预,但缺乏动物或患者样本验证。

主要模型

C2C12小鼠成肌细胞 C2C12肌管分化模型 地塞米松诱导的肌肉萎缩体外模型

重点核对

MRJPs处理浓度:0、4、8、10 mg/mL 分化时间:6天 地塞米松浓度:10 μM,处理24小时 Mdivi-1浓度:20 μM,处理24小时 统计设计:每组3个重复,采用T检验和单因素方差分析(Tukey事后检验)

摘要

蜂王浆(RJ)已被广泛用作促进健康的补充剂,其生物活性成分是主要蜂王浆蛋白(MRJPs)。MRJPs是否促进骨骼肌细胞发育仍不清楚。肌肉功能障碍与线粒体耗竭和蛋白质分解有关。因此,我们评估了MRJPs如何影响肌管分化。使用荧光显微镜和考马斯亮蓝染色测量肌管的形态和数量,并通过Western blotting或qRT-PCR分析MyoD、MyoG、肌球蛋白重链(MyHC)和肌肉环指蛋白1(MuRF-1)的表达来评估C2C12肌管分化。使用荧光探针评估线粒体功能,而通过分析相关蛋白的表达来确定线粒体的含量。使用Western blotting检测肌球蛋白相关蛋白、自噬相关蛋白、凋亡相关蛋白和线粒体相关蛋白的表达。通过肌管密度和长度的增加,以及MyoD、MyoG和MyHC的mRNA和蛋白表达增加证明了这一点。在本研究中,我们发现MRJPs促进了C2C12成肌细胞分化形成肌管,但不能逆转Dex诱导的肌肉萎缩。可能的机制是MRJPs减少凋亡,增加细胞自噬,刺激线粒体生物发生,促进线粒体动力学稳态和线粒体自噬,并防止线粒体膜电位的丧失。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
MRJPs是否促进C2C12成肌细胞分化,其作用机制是否与线粒体功能改善有关?
核心机制
MRJPs通过减少凋亡、增强自噬、刺激线粒体生物发生、促进线粒体动力学稳态和线粒体自噬,并防止线粒体膜电位丧失,从而促进肌管分化。
主要证据
MRJPs (8 mg/mL) 处理6天后,C2C12肌管密度和长度增加,MyoD、MyoG、MyHC表达上调;LC3-II/I比值和Beclin1增加,Bax/Bcl-2降低;PGC-1α、UCP-1、OPA1、MFN2、DRP1、PINK1、Parkin、BNIP3表达增加;JC-1红/绿比值增加,ROS无显著变化。
研究意义
MRJPs可能作为通过增强线粒体功能促进骨骼肌分化功能的活性成分,但作者指出其在肌少症中的治疗价值尚需体内研究验证。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

MRJPs提取与鉴定

获得MRJPs并验证其组成

从新鲜蜂王浆中通过离心、透析和冻干提取MRJPs,并用SDS-PAGE分析其蛋白条带。

2

C2C12细胞培养与分化

建立肌管分化模型并评估MRJPs的最佳浓度

将C2C12成肌细胞在含不同浓度MRJPs的分化培养基中培养6天,诱导肌管形成。

3

肌管形态学评估

验证MRJPs对肌管形成的促进作用

使用考马斯亮蓝染色和MyHC免疫荧光染色,观察肌管形态、密度和长度。

4

肌源性因子表达检测

评估MRJPs对肌生成标志物的影响

通过RT-qPCR和Western blot检测MyoD、MyoG、Mrf4、MyHC IIb和MuRF-1的表达。

5

凋亡和自噬检测

评估MRJPs对细胞凋亡和自噬的影响

通过Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和自噬相关蛋白LC3、Beclin1的表达。

6

线粒体功能评估

评估MRJPs对线粒体生物发生、动力学、自噬和功能的影响

通过Western blot检测PGC-1α、UCP-1、OPA1、MFN2、DRP1、PINK1、Parkin、BNIP3的表达;使用JC-1染色评估线粒体膜电位,DCFH-DA检测ROS水平。

7

药物干预验证机制

验证MRJPs是否通过线粒体分裂和线粒体自噬促进分化,以及能否逆转地塞米松诱导的萎缩

将分化4天的肌管用MRJPs(8 mg/mL)、Dex(10 μM)和Mdivi-1(20 μM)单独或联合处理24小时,检测肌管形态、相关蛋白表达。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
磷酸盐缓冲液(pH 7.0)----
透析膜SolarbioYA1072
冻干机(Alpha 1-4 LD plus)ChristAlpha
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0010
考马斯亮蓝快速染色液BeyotimeP0017
DMEM培养基BasalMediaL310KJ
胎牛血清Pricella1641010-50
青霉素/链霉素SolarbioP1400
马血清NewzerumES-500
地塞米松MCEHY-14648
Mdivi-1MCEHY-15886
总RNA提取试剂盒TIANGENDP430
HiScript III RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)VazymeR323
Maxima SYBR Green qPCR预混液(2X)BimakeB21202
RIPA裂解液SolarbioR0010
ECL化学发光底物试剂盒ABclonalRM02867
化学发光凝胶成像系统(Tanon 5200)Tanon5200
DCFH-DA荧光探针BeyotimeS0033S
JC-1染色液BeyotimeC2003S
DAPISolarbioC0065
抗荧光淬灭剂SolarbioS2100
倒置荧光显微镜(IX73+DP80)OlympusIX73+DP80
激光共聚焦显微镜OLYMPUSFV3000
多功能荧光酶标仪(Spark)TecanSpark

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
MRJPs提取
蜂王浆与磷酸盐缓冲液的比例、离心转速和时间、透析时间、冻干时间
阅读提示:Materials and methods 2.1
细胞培养与分化
细胞接种密度、培养基成分、MRJPs浓度、分化时间、培养基更换频率
阅读提示:Materials and methods 2.4
药物处理模型
Dex浓度、Mdivi-1浓度、处理时间、分化天数
阅读提示:Materials and methods 2.5, Results 3.8
分子检测
RT-qPCR的内参基因、Western blot的抗体稀释度、蛋白定量方法
阅读提示:Materials and methods 2.7, 2.8
线粒体功能检测
JC-1染色孵育时间、DCFH-DA浓度和孵育时间、荧光检测波长时间
阅读提示:Materials and methods 2.9, 2.10