含药血清制备与蛋白质组学/代谢组学分析
鉴定SRW影响的关键蛋白和代谢通路，探索其抗衰老潜在机制。
制备SRW含药血清，处理293T细胞，进行iTRAQ/TMT定量蛋白质组学和UPLC-MS/MS代谢组学分析，结合网络药理学预测靶点。
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参茸固本还少丸中的黄酮类化合物通过NDUFV2和LDHB介导的代谢重编程缓解衰老相关的线粒体功能障碍
Flavonoid compounds from Shenrong Guben Huanshao Pill alleviates senescence-associated mitochondrial dysfunction through NDUFV2 and LDHB mediated metabolic reprogramming.
实验完整度
高体外多种细胞(293T/3T3/WI-38/IEC-6)衰老模型、体内多模型(X射线辐射、D-Gal系统衰老、APP/PS1 AD模型)验证，并包含蛋白质组学、代谢组学及siRNA干扰等机制验证。
主要模型
293T细胞 NIH/3T3细胞 WI-38细胞 X射线诱导的肠衰老小鼠模型
重点核对
D-Gal诱导细胞衰老模型，浓度60 mg/mL SRW含药血清处理浓度5%，处理24小时 siRNA敲低NDUFV2/LDHB，转染48小时检测蛋白 X射线照射建立小鼠肠衰老模型，设置SRW和Dex处理组 统计分析：每个实验独立重复6次，采用t检验或单因素方差分析
摘要
衰老被广泛认为是许多慢性疾病发生和发展的关键驱动因素。尽管大量动物研究表明多种药物可以延缓衰老，但由于显著的毒副作用，其临床应用受到严重限制。因此，开发更安全的天然抗衰老药物已成为当务之急。在本研究中，我们确定了线粒体功能障碍是细胞衰老的关键因素。此外，我们确定参茸固本还少丸(SRW)是一种有效的药物，通过调节线粒体代谢来缓解线粒体功能障碍，从而延缓细胞衰老。机制上，SRW通过上调线粒体呼吸链复合物I的核心组分还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH):泛醌氧化还原酶亚基V2(NDUFV2)的表达来增强线粒体功能。同时，SRW通过调节糖酵解酶乳酸脱氢酶B(LDHB)减少乳酸积累，从而减轻乳酸诱导的线粒体功能障碍。总之，我们的研究结果表明，SRW通过协调调节NDUFV2的表达和LDHB介导的乳酸代谢来改善线粒体功能，从而缓解细胞衰老。此外，SRW中的几种黄酮类化合物被鉴定具有潜在的抗衰老活性。分子对接和细胞实验证实，杨梅素、木犀草素和伽马倒捻子素能有效缓解细胞衰老。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 参茸固本还少丸(SRW)能否以及如何通过调节线粒体功能来延缓细胞衰老？
- 核心机制
- SRW通过上调NDUFV2增强线粒体呼吸链复合物I活性，同时上调LDHB促进乳酸转化为丙酮酸，减少乳酸积累，从而协同改善线粒体功能，延缓细胞衰老。
- 主要证据
- 在D-Gal诱导的WI-38/3T3细胞和X射线诱导的小鼠肠衰老模型中，SRW降低衰老标志物p16/p21；蛋白质组学和代谢组学显示NDUFV2和LDHB变化；siRNA敲低NDUFV2或LDHB逆转SRW的线粒体保护作用。
- 研究意义
- 本研究为SRW在衰老相关疾病中的治疗作用和机制提供了理论和实验依据，并为抗衰老药物开发提供了新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞衰老模型验证抗衰老效果
验证SRW是否缓解D-Gal诱导的细胞衰老和细胞周期阻滞。
使用WI-38、3T3、IEC-6等细胞，D-Gal诱导衰老，SRW或雷帕霉素处理，检测衰老标志物、β-半乳糖苷酶染色、细胞周期。
体内动物模型验证抗衰老效果
验证SRW在体内多种衰老模型中的保护作用。
建立X射线诱导的肠道衰老小鼠模型、D-Gal诱导的系统衰老小鼠模型和APP/PS1阿尔茨海默病小鼠模型，评估组织病理、衰老标志物和认知功能。
线粒体功能评估与机制初探
探讨SRW是否通过改善线粒体功能来延缓衰老。
检测ATP含量、线粒体膜电位、ROS水平、线粒体形态（TEM），并检测线粒体分裂/融合蛋白FIS1、OPA1、PHB2等。
NDUFV2和LDHB的机制验证
验证NDUFV2和LDHB是否介导SRW的线粒体保护作用。
通过siRNA敲低NDUFV2或LDHB，及双敲低，观察对线粒体功能、乳酸水平、衰老标志物和ATP的影响。
活性成分筛选与验证
鉴定SRW中具有抗衰老活性的具体化合物。
通过UPLC-MS/MS鉴定入血成分，筛选黄酮类化合物，对NDUFV2和LDHB进行分子对接，并用细胞实验验证抗衰老活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | D-半乳糖 | Aladdin | G100367 |
| 药物处理 | 雷帕霉素 | Aladdin | S115842 |
| ATP检测 | ATP含量检测试剂盒 | Solarbio | BC0300 |
| 乳酸检测 | 乳酸含量检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | A019-2-1 |
| 衰老检测 | β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Beyotime | C0602 |
| ROS检测 | DCFH-DA荧光探针 | Solarbio | D6470 |
| 线粒体染色 | MitoTracker绿色荧光探针 | Beyotime | C1048 |
| 线粒体膜电位检测 | JC-1染料 | Solarbio | M8650 |
| 线粒体ROS检测 | MitoSOX红色荧光探针 | Hongye | GLPBIO-GC68230 |
| 凋亡检测 | Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1512 |
| 细胞周期检测 | 细胞周期与凋亡检测试剂盒 | Servicebio | G1700 |
| 药物 | 参茸固本还少丸 | Foci Pharmaceutical | Z20043832 |
| 活性成分 | 杨梅素 | Aladdin | M111175 |
| 木犀草素 | Aladdin | L107329 | |
| 伽马倒捻子素 | Vicky Biotechnology | 31271-07-5 | |
| 蛋白质提取 | RIPA裂解液 | Solarbio | R0010 |
| BCA定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | KeyGen Biotech | KGB2101-250 |
| 细胞核染色 | DAPI染料 | Solarbio | S2110 |
| siRNA转染 | GenePharma siRNA-mate Plus转染试剂盒 | GenePharma | G04026 |
| 动物实验 | SD大鼠 | -- | -- |
| C57BL/6J小鼠 | -- | -- | |
| APP/PS1小鼠 | Shulaibao Biotechnology | -- | |
| 细胞培养 | 293T细胞系 | Procell Life Science & Technology | CL-0005 |
| WI-38细胞系 | Procell Life Science & Technology | CL-0243 | |
| NIH/3T3细胞系 | Procell Life Science & Technology | CL-0171 | |
| IEC-6细胞系 | Procell Life Science & Technology | CL-0419 | |
| 仪器 | X-RAD Smart小动物精准放疗系统 | Precision X-Ray, Inc. | -- |
| Zeiss激光扫描共聚焦显微镜LM900 | Carl Zeiss AG | -- | |
| Agilent流式细胞仪NovoCyte Quanteon | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| 全景组织细胞扫描系统 | TissueGnostics GmbH | -- | |
| Agilent多功能酶标仪Synergy NEO2 | Agilent Technologies, Inc. | -- | |
| Nikon正置显微镜系统 | Nikon Corporation | -- | |
| Nikon倒置显微镜 | Nikon Corporation | -- | |
| Thermo Fisher Scientific活细胞荧光显微成像系统 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 组织冷冻研磨机 | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | -- | |
| 超声波细胞破碎仪 | Ningbo Xinzhi Biotechnology Co., Ltd. | -- | |
| 高速冷冻离心机 | Eppendorf AG | -- | |
| 透射电子显微镜 | Hitachi High-Tech Corporation | -- | |
| RIGOL L-3000高效液相色谱系统 | RIGOL Technologies Co., Ltd. | -- | |
| 液相色谱仪 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 质谱仪 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | -- | |
| 蛋白电泳 | PVDF膜 | -- | -- |
| SDS-PAGE凝胶电泳 | -- | -- | |
| ECL检测 | 增强化学发光检测 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞衰老模型建立 | D-Gal浓度60 mg/mL，处理时间，细胞类型（WI-38、3T3、IEC-6等） 阅读提示：参见Materials and Methods部分‘细胞培养与衰老诱导’及Figure legends |
| SRW药物干预 | SRW含药血清浓度（5%），处理时间（24小时），给药途径和剂量（体内：2.52 g/kg 大鼠，人等效剂量0.4 g/kg） 阅读提示：参见Materials and Methods ‘Preparation of drug-containing serum, animal model establishment, and drug intervention’ |
| 线粒体功能检测 | ATP含量、JC-1膜电位、MitoTracker/MitoSOX染色浓度和孵育时间，透射电镜样品制备参数 阅读提示：参见Materials and Methods ‘MitoTracker staining, DCFH-DA staining, MitoSox red staining, β-galactosidase staining and JC-1 staining’及‘Transmission electron microscopy’ |
| 机制验证（siRNA敲低） | siRNA序列（NDUFV2和LDHB），转染浓度（15 pmol），转染时间（48小时） 阅读提示：参见Materials and Methods ‘Small interfering RNA transfection (siRNA)’ |
| 统计学设计 | 独立重复次数（6次）、统计方法（t检验或单因素方差分析）、显著性阈值（P<0.05） 阅读提示：参见Materials and Methods ‘Statistical analysis’ |