单细胞转录组和代谢组分析
鉴定URPL蜕膜免疫细胞特别是dMφs的转录和代谢异常
整合GSE214607和PRJNA672658数据集进行scRNA-seq分析，对dMφs进行聚类和差异表达分析；对蜕膜组织进行靶向代谢组学检测色氨酸代谢物。
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过度的犬尿氨酸代谢通过蜕膜巨噬细胞中的AHR/CISH/ATP6V1A轴损害溶酶体酸化和触发mtDNA释放，与不明原因复发性流产相关
Excessive Kynurenine Metabolism Impairs Lysosomal acidification and Triggers mtDNA Release via the AHR/CISH/ATP6V1A Axis in Decidual Macrophages Associated with Unexplained Recurrent Pregnancy Loss.
实验完整度
高整合scRNA-seq、代谢组学、体外细胞实验、动物模型及机制验证（CUT&Tag、ChIP、Co-IP、泛素化），包含功能验证和机制验证。
主要模型
人蜕膜巨噬细胞（dMφs） THP-1来源巨噬细胞（THP-1-Mφs） HTR-8/SVneo滋养层细胞系 CBA/J×DBA/2小鼠流产模型
重点核对
KYN处理浓度：10 mg/kg（小鼠）或25 μM（细胞） CH223191给药剂量：20 μg/kg，腹腔注射 KYN处理时间：GD0.5至GD12.5（小鼠） CISH敲低（siCISH）验证 ATP6V1A过表达（OE-ATP6V1A）验证
摘要
蜕膜巨噬细胞（dMφs）的代谢紊乱可能有助于流产的病理过程，然而其潜在机制仍不清楚。在此，我们记录了不明原因复发性流产（URPL）女性dMφs中色氨酸代谢通路上调，蜕膜中犬尿氨酸（KYN）水平升高，dMφs中芳基烃受体（AHR）表达升高。KYN-AHR轴的过度激活损害线粒体和溶酶体的完整性。这种损伤促进mtDNA泄漏到细胞质中，随后释放到细胞外空间，从而激活cGAS-STING信号级联。机制上，AHR直接结合CISH启动子区域中的异源生物反应元件，促进其转录。CISH的上调促进ATP6V1A的泛素化和降解，破坏溶酶体酸化并加剧mtDNA释放。在体内，怀孕小鼠过量施用KYN会增加胚胎吸收率，而AHR的药理学抑制部分减弱dMφs中cGAS-STING通路的激活，并在易流产小鼠模型中改善胎儿丢失。总之，我们的研究结果描述了AHR/CISH/ATP6V1A轴在协调蜕膜内免疫功能障碍中的关键作用，可能有助于URPL，这为URPL的潜在发病机制提供了新的见解，并为改善妊娠结局铺平了道路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蜕膜巨噬细胞中色氨酸代谢异常是否参与不明原因复发性流产（URPL）的发病，其具体分子机制是什么？
- 核心机制
- KYN激活AHR，AHR直接结合CISH启动子中的XRE2元件促进CISH转录；CISH促进ATP6V1A的泛素化和蛋白酶体降解，导致溶酶体酸化受损，mtDNA泄漏并释放到胞外，激活cGAS-STING通路，诱发炎症并损害滋养层功能。
- 主要证据
- 通过scRNA-seq和代谢组学证实URPL蜕膜中KYN升高；体外实验显示KYN处理上调AHR和CISH，CISH敲低或ATP6V1A过表达逆转溶酶体酸化缺陷和mtDNA释放；CUT&Tag和ChIP证实AHR结合CISH启动子；体内AP小鼠模型中CH223191抑制AHR可降低胚胎吸收率。
- 研究意义
- 该研究首次揭示KYN-AHR-CISH-ATP6V1A轴在URPL发病中的关键作用，为URPL的发病机制提供了新见解，并为临床干预提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
KYN处理细胞和小鼠模型验证AHR上调
评估KYN是否在体外和体内上调AHR表达并影响妊娠结局
用KYN处理THP-1-Mφs和人原代dMφs；对孕鼠腹腔注射KYN，检测胚胎吸收率和dMφs中AHR表达。
AHR过表达及转录组分析
探究AHR激活对巨噬细胞基因表达和信号通路的影响
在THP-1-Mφs中过表达AHR（OE-AHR），进行RNA-seq和Western blot验证cGAS-STING通路激活。
CUT&Tag和ChIP分析
鉴定AHR的全基因组结合位点并验证其直接调控CISH
使用CUT&Tag技术鉴定AHR结合峰；通过JASPAR和PROMO预测CISH启动子上的XRE元件；用双荧光素酶报告基因和ChIP-qPCR验证AHR与XRE2的结合。
溶酶体功能和mtDNA释放检测
验证AHR激活是否导致溶酶体酸化和mtDNA释放
使用LysoSensor检测溶酶体pH，Cathepsin B活性检测，RT-qPCR定量胞质和胞外mtDNA。
CISH和ATP6V1A功能验证
验证CISH介导ATP6V1A降解并影响溶酶体功能
通过siRNA敲低CISH和过表达ATP6V1A，检测溶酶体酸化和mtDNA释放；Co-IP检测CISH与ATP6V1A相互作用；泛素化实验检测ATP6V1A泛素化水平。
共培养实验评估滋养层功能
验证AHR激活的巨噬细胞通过释放mtDNA损害滋养层功能
将dMφs或THP-1-Mφs与HTR-8/SVneo细胞、原代EVTs或hTSCs-EVTs共培养，检测凋亡、迁移和侵袭。
体内CH223191治疗实验
验证AHR抑制能否改善流产小鼠模型的胚胎丢失
构建AP小鼠模型，给予CH223191腹腔注射，检测胚胎吸收率和cGAS-STING通路蛋白表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| dMφs分离 | IV型胶原酶 | Millipore Sigma | C5138 |
| 脱氧核糖核酸酶I | Millipore Sigma | 10104159001 | |
| Ficoll介质 | GE Healthcare | 17144002 | |
| CD14微珠 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
| 流式细胞术 | 可固定活性染料450 | BD Biosciences | 562247 |
| FITC抗人CD14抗体 | BioLegend | 982502 | |
| APC-Cy7抗人CD45抗体 | BioLegend | 304014 | |
| PE-Cy7抗人AHR抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25-5925-82 | |
| 小鼠模型 | CH223191 | MedChem Express | HY-12684 |
| 犬尿氨酸 | MedChem Express | HY-104026 | |
| 细胞培养 | THP-1特异性培养基 | Procell | CM-0233 |
| 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | C11875500BT | |
| 胎牛血清 | Pansera | ST30-2602 | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11728 | |
| SYBR Green qPCR试剂盒 | Accurate Biology | AG11701 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1045 | |
| BCA蛋白检测试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| PVDF膜 | Roche | 03010040001 | |
| 线粒体功能检测 | MitoSOX Red染料 | Thermo Fisher Scientific | M36007 |
| JC-1染料 | Beyotime Biotechnology | C2006 | |
| Hoechst 33342染料 | Thermo Fisher Scientific | 62249 | |
| 溶酶体功能检测 | LysoSensor Green DND-189染料 | Thermo Fisher Scientific | A66436 |
| 组织蛋白酶B活性检测试剂盒 | Abcam | ab65300 | |
| mtDNA检测 | DNeasy血液和组织试剂盒 | Qiagen | 69504 |
| 人线粒体DNA监测引物组 | Takara | BA0001 | |
| CUT&Tag | NovoNGS CUT&Tag 4.0高灵敏度试剂盒 | NovoProtein | N259-YH01-01A |
| AHR特异性抗体 | Cell Signaling Technology | 83200 | |
| 荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corporation | E1960 |
| ChIP | 兔多克隆IgG同型对照抗体 | Proteintech | 10284-1-AP |
| 蛋白A/G磁珠 | Thermo Fisher Scientific | 88803 | |
| QIAquick PCR纯化试剂盒 | QIAGEN | A-28106 | |
| TB Green Premix Ex Taq II | Takara | RR820A | |
| Co-IP | 蛋白A/G磁珠 | Selleck Chemicals | 23201 |
| 免疫沉淀裂解缓冲液 | Beyotime | P0013 | |
| EVTs分离 | Ficoll介质 | GE Healthcare | 17144002 |
| PE偶联抗HLA-G抗体 | Abcam | ab24384 | |
| 抗PE微珠 | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | |
| hTSCs培养 | IV型胶原 | -- | -- |
| 胎牛血清 | ThermoFisher | 10099141 | |
| 青霉素-链霉素 | ThermoFisher | 15140122 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A9418 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒-X | BasalMedia | S452J7 | |
| A83-01 | MedChemExpress | HY-10432A | |
| SB431542 | MedChemExpress | HY-10431 | |
| Y27632 | Selleck | S1049 | |
| 丙戊酸 | MedChemExpress | HY-10585 | |
| CHIR99021 | Selleck | S1263 | |
| TrypLE消化液 | Thermo Fisher Scientific | 12604021 | |
| hTSCs-EVTs分化 | 神经调节蛋白1 | CST | 26941 |
| KnockOut血清替代物 | ThermoFisher | 10828010 | |
| Matrigel基质胶 | Corning | 356231 | |
| 共培养 | Transwell系统 | Corning | 3412 |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1383L |
| 侵袭实验 | Transwell小室 | Corning | 3428 |
| Matrigel基质胶 | BD Biosciences | 356234 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 人样本收集 | URPL和正常妊娠组各30例蜕膜组织；排除标准包括染色体异常等；伦理批准号2021-746 阅读提示：Materials and Methods: Clinical sample collection |
| 代谢组学 | 样本量：URPL和正常各10例；样品制备：50 mg组织，提取液比例；UHPLC-MS/MS条件；差异代谢物筛选阈值p<0.05 阅读提示：Materials and Methods: Targeted metabolomics |
| dMφs分离和培养 | 消化酶：0.1% collagenase IV和0.01% DNase I；密度梯度离心条件（1000×g，20min）；CD14磁珠分选；培养基RPMI 1640+10%FBS+1%PS 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of human dMφs |
| 流式细胞术 | 抗体：FVS450、FITC-CD14、APC-Cy7-CD45、PE-Cy7-AHR；孵育条件：4℃ 30min；固定和破膜步骤 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry analysis |
| 小鼠模型 | NP：CBA/J♀×BALB/c♂；AP：CBA/J♀×DBA/2♂；KYN注射剂量10mg/kg；CH223191剂量20μg/kg；时间GD0.5-12.5或GD6.5-12.5；评估GD13.5 阅读提示：Materials and Methods: Mouse model |
| 细胞培养和分化 | THP-1细胞培养于Procell培养基；PMA浓度100ng/mL处理24h；HTR-8/SVneo培养条件 阅读提示：Materials and Methods: Cell line culture |
| RNA-seq | AHR过表达和对照；建库试剂盒NEBNext；差异基因阈值：FPKM≥1，FC≥1.5，adj p≤0.05 阅读提示：Materials and Methods: RNA-seq and data analysis |
| RT-qPCR | TRIzol提取；逆转录试剂盒；SYBR Green；CFX96仪器；引物见表S2 阅读提示：Materials and Methods: Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction |
| Western blot | RIPA裂解；BCA定量；SDS-PAGE；PVDF膜；一抗稀释比和来源见表S3 阅读提示：Materials and Methods: Western blotting |
| 线粒体功能检测 | MitoSOX浓度5μM；JC-1处理；Hoechst 33342浓度1μg/mL；孵育时间和温度 阅读提示：Materials and Methods: Measurement of mitochondrial function |
| 溶酶体功能检测 | LysoSensor浓度1μM孵育1小时；Cathepsin B活性试剂盒操作；蛋白量200μg 阅读提示：Materials and Methods: Lysosomal acidification and cathepsin B activity assay |
| mtDNA定量 | 细胞密度1×10^6/孔；培养24小时收集上清；DNA提取试剂盒；RT-qPCR引物（Takara BA0001） 阅读提示：Materials and Methods: mtDNA quantification |
| CUT&Tag | 细胞数1×10^5；甲醛固定；AHR抗体（CST 83200）；测序平台Illumina；比对参数 阅读提示：Materials and Methods: Cleavage Under Targets and Tagmentation |
| 双荧光素酶报告基因 | CISH启动子构建WT和突变体；共转染AHR过表达质粒；pRL-TK内参；试剂盒Promega E1960 阅读提示：Materials and Methods: Luciferase reporter assay |
| ChIP | 甲醛固定；染色质断裂大小；AHR抗体和IgG对照；磁珠；qPCR引物序列 阅读提示：Materials and Methods: Chromatin Immunoprecipitation |
| Co-IP | 细胞裂解和IP条件；抗体信息（表S3） 阅读提示：Materials and Methods: Co-immunoprecipitation |
| 原代EVTs分离 | 胰酶消化时间8分钟；HLA-G抗体（ab24384）；磁珠分选；共培养条件 阅读提示：Materials and Methods: Isolation of primary EVTs |
| hTSCs培养和分化 | 培养基成分和浓度（如表）；Matrigel浓度；分化时间 阅读提示：Materials and Methods: Culture of hTSCs and EVTs differentiation |
| 凋亡分析 | Annexin V-FITC/PI染色；结合缓冲液；30分钟室温孵育；流式检测 阅读提示：Materials and Methods: Apoptosis analysis |
| 侵袭实验 | Matrigel浓度1:8稀释；细胞数5×10^4；血清趋化；48小时孵育 阅读提示：Materials and Methods: Cell invasion assay |
| 划痕实验 | 细胞汇合度90%；10μL枪头划痕；0小时和24小时观察 阅读提示：Materials and Methods: Wound healing assay |