临床样本和细胞系中SREBP2表达分析
验证SREBP2在结直肠癌组织和细胞系中的表达情况。
对47对CRC肿瘤及癌旁组织进行RT-qPCR、Western blot和IHC检测SREBP2表达；对NCM460细胞和6种CRC细胞系进行RT-qPCR和Western blot检测。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
SREBP2通过靶向GPX4赋予结直肠癌铁死亡抵抗性
SREBP2 confers ferroptosis resistance by targeting GPX4 in colorectal cancer.
实验完整度
高包含临床样本、体外细胞功能实验、RNA-seq、ChIP、荧光素酶报告基因、皮下移植瘤模型等多个独立证据层级，并有功能验证和机制验证。
主要模型
结直肠癌临床组织样本（47例配对肿瘤及癌旁组织） HT29和RKO结直肠癌细胞系 皮下移植瘤模型（BALB/c裸鼠） APCmin/+小鼠
重点核对
SREBP2在HT29和RKO细胞中敲低或使用6 µg/mL白桦脂醇处理24小时 Erastin诱导铁死亡，浓度及处理时间需在原文补充材料中确认 皮下移植瘤模型中HT29细胞注射量为5×10⁶个细胞，每组6只裸鼠 白桦脂醇治疗剂量为20 mg/kg/day，经口服灌胃给药，从细胞注射后第3天开始，持续14天 统计设计：至少三次独立实验，配对t检验、双尾Student's t检验和单因素方差分析，p<0.05为显著性阈值
摘要
背景：甾醇调节元件结合蛋白2（SREBP2）表达上调已在多种恶性肿瘤中观察到。铁死亡是一种铁依赖性的、由脂质过氧化物积累驱动的细胞死亡形式，近年来在结直肠癌（CRC）研究中受到广泛关注。本研究旨在探讨SREBP2在CRC铁死亡抵抗中的作用及其潜在分子机制。方法：评估了SREBP2在CRC中的表达。在SREBP2敲低或使用SREBP2抑制剂白桦脂醇处理后，对HT29和RKO细胞进行了功能实验。利用RNA-seq筛选SREBP2的潜在下游靶标。机制上，铁死亡相关标志物和拯救实验揭示了SREBP2通过调控GPX4表达介导的CRC铁死亡抵抗的关系。此外，ChIP和荧光素酶实验用于确认调控SREBP2表达的上游因子。最后，采用皮下肿瘤发生模型评估靶向SREBP2在CRC中的治疗潜力。结果：CRC中SREBP2表达上调驱动CRC细胞的增殖、迁移和侵袭。机制上，SREBP2直接增加GPX4的转录，从而降低CRC对铁死亡的敏感性并促进CRC进展。此外，β-catenin被确定为SREBP2的上游调控因子。抑制SREBP2使CRC细胞对铁死亡敏感并抑制肿瘤生长。结论：SREBP2通过上调GPX4增强CRC的铁死亡抵抗性，从而促进肿瘤进展。我们的发现强调SREBP2作为潜在治疗靶点，并为开发靶向SREBP2的结直肠癌治疗策略提供了依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SREBP2在结直肠癌中是否通过调控GPX4影响铁死亡抵抗，从而促进肿瘤进展？
- 核心机制
- SREBP2作为转录因子直接结合GPX4启动子区域（-431至-422 bp），上调GPX4转录，增强GPX4介导的脂质过氧化物还原能力，从而抑制铁死亡，促进CRC进展；β-catenin/TCF4复合物转录上调SREBP2表达。
- 主要证据
- 临床样本中SREBP2高表达；siRNA敲低SREBP2抑制细胞增殖、迁移和侵袭，降低GPX4表达并增加铁死亡敏感性；ChIP和荧光素酶实验证实SREBP2直接结合GPX4启动子；皮下移植瘤模型中SREBP2敲除或白桦脂醇治疗抑制肿瘤生长并促进铁死亡。
- 研究意义
- 本研究揭示SREBP2作为CRC铁死亡负调控因子的新作用，为CRC治疗提供潜在靶点，并为白桦脂醇的临床应用提供理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能实验：敲低SREBP2或白桦脂醇处理
评估SREBP2对CRC细胞增殖、迁移和侵袭的影响。
在HT29和RKO细胞中通过siRNA敲低SREBP2或用6 µg/mL白桦脂醇处理，进行CCK-8、集落形成、伤口愈合和Transwell实验。
RNA-seq筛选下游靶基因
识别SREBP2调控的潜在下游信号通路和基因。
在HT29细胞中敲低SREBP2后进行RNA-seq，通过KEGG和GSEA分析富集通路，并用qPCR和Western blot验证差异表达基因。
验证SREBP2直接调控GPX4转录
证明SREBP2直接结合GPX4启动子并增强其转录活性。
通过ChIP-qPCR检测SREBP2与GPX4启动子的结合；利用GPX4启动子荧光素酶报告质粒（野生型和突变型）进行双荧光素酶实验。
铁死亡相关指标检测和拯救实验
验证SREBP2通过GPX4调控CRC细胞铁死亡敏感性。
在HT29细胞中敲低或过表达SREBP2，检测MDA、ROS、Fe²⁺、GSH/GSSG比例和脂质过氧化；通过GPX4敲低或过表达进行拯救实验。
验证β-catenin调控SREBP2转录
鉴定SREBP2上游转录调控因子。
敲低β-catenin后检测SREBP2和GPX4表达；通过ChIP和Co-IP验证β-catenin/TCF4复合物结合SREBP2启动子；使用SREBP2启动子荧光素酶报告质粒（野生型和突变型）检测转录活性。
体内实验验证SREBP2抑制剂的抗肿瘤效果
评估靶向SREBP2在体内的抗肿瘤作用。
将HT29-SREBP2-KO细胞或对照细胞皮下注射裸鼠，或对HT29野生型细胞移植瘤给予白桦脂醇治疗，检测肿瘤体积、重量、Ki-67、GPX4、4-HNE等指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Vazyme | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 重组人非必需氨基酸 | MCE | -- | |
| 细胞转染 | Lipomaster 3000转染试剂 | Vazyme | -- |
| 嘌呤霉素 | Solarbio | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | CWBIO | -- |
| 硝酸纤维素膜 | PALL | -- | |
| Mini-PROTEAN Tetra电泳槽 | BIO RAD | -- | |
| Trans-Blot Turbo转印系统 | BIO RAD | -- | |
| Odyssey CLX Western blot成像系统 | LI-COR | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol RNA提取试剂 | Invitrogen | -- |
| HiScript III qRT SuperMix | Vazyme | -- | |
| ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix | Vazyme | -- | |
| RNA-seq | Illumina链特异性mRNA文库制备 | Illumina | -- |
| MDA检测 | MDA比色检测试剂盒 | Elabscience | WW056V6×8360 |
| Fe2+检测 | 细胞亚铁离子比色检测试剂盒 | Elabscience | WU03JZN62369 |
| ROS检测 | DCFDA/H2DCFDA细胞活性氧检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 脂质过氧化检测 | 581/591 C-11 BODIPY染料 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 胆固醇检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | Nanning Jiancheng | A111-1-1 |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| ChIP | Protein A/G PLUS-琼脂糖珠 | Santa Cruz Biotechnology | -- |
| 动物实验 | 白桦脂醇 | MCE | -- |
| PEG300 | MCE | -- | |
| 抗体 | 抗SREBP2抗体 | Proteintech | 28212-1-AP |
| 抗GPX4抗体 | santa | sc-166570 | |
| 抗ACSL4抗体 | Proteintech | 22401-1-AP | |
| 抗SLC7A11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗β-catenin抗体 | CST | #8480 | |
| 抗活化β-catenin抗体 | CST | #19807 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz | sc-376421 | |
| 抗TCF4抗体 | Santa Cruz | sc-166699 | |
| Western blot | IRDye二抗 | LI-COR | -- |
| 细胞计数 | CCK-8试剂盒 | Vazyme | -- |
| Transwell实验 | Transwell小室（8.0 μm孔径） | Corning | -- |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 显微镜 | Axio scope5显微镜 | ZESIS | -- |
| Axio observer3显微镜 | ZESIS | -- | |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 微孔板读板机 | SpectraMax iD5e多功能微孔板读板机 | Molecular Devices | -- |
| PCR | Biometra TAdvanced PCR仪 | analytik-jena | -- |
| qPCR | qTOWER3G实时荧光定量PCR仪 | analytik-jena | -- |
| 免疫组化 | DAB显色液 | Maxim | -- |
| 牛血清白蛋白 | neofroxx | -- | |
| 磷酸盐缓冲液 | servicebio | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者样本数量、收集时间、纳入和排除标准、组织处理方法 阅读提示：Materials and methods 中的 Patient samples 部分 |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基成分（如FBS浓度、NEAA浓度）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell culture 部分 |
| 基因敲低和过表达 | siRNA序列、转染试剂（Lipomaster 3000）、质粒构建细节 阅读提示：Materials and methods 中的 Virus packaging and cell transfection 部分及补充表1-3 |
| 细胞增殖、迁移和侵袭 | 细胞接种数量、处理时间、Transwell孔径和基质胶包被 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell proliferation assay、Cell migration and invasion assays 部分 |
| RNA-seq | 测序平台、文库制备方法、差异基因筛选标准（如fold change和p值） 阅读提示：Materials and methods 中的 RNA-sequencing and analysis 部分 |
| 铁死亡相关检测 | MDA、Fe²⁺、GSH/GSSG、ROS检测试剂盒的具体货号和方法，细胞处理条件（如Erastin浓度和时间） 阅读提示：Materials and methods 中的 MDA level measurement、Fe2+ level measurement、GSH/GSSG level measurement、Measurement of reactive oxygen species (ROS)、Lipid peroxidation assay 部分 |
| 机制验证 | ChIP和荧光素酶实验中的启动子区域、抗体、突变体构建 阅读提示：Materials and methods 中的 Luciferase reporter assay、Chromatin Immunoprecipitation (ChIP)、Coimmunoprecipitation (Co-IP) 部分 |
| 动物实验 | 小鼠品系、周龄、性别、细胞注射量、给药剂量、给药途径、治疗时间 阅读提示：Materials and methods 中的 Animal experiments 部分 |