建立Hepa1-6小鼠模型并评估联合治疗疗效
验证RT联合抗PD-1在体内对HCC的抑制作用
将Hepa1-6细胞皮下注射至BALB/c小鼠，分为对照组、RT组、抗PD-1组和联合治疗组，测量肿瘤体积，进行H&E和TUNEL染色。
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放疗联合抗PD-1免疫治疗通过铁死亡驱动肝细胞癌的控制
Radiotherapy combined with anti-PD-1 immunotherapy promotes ferroptosis-driven control of hepatocellular carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型、MeRIP-seq、代谢组学等多层级验证，且明确了机制验证。
主要模型
Hepa1-6小鼠肝癌细胞 BALB/c小鼠皮下移植瘤模型 Hepa1-6荷瘤小鼠
重点核对
RT剂量：8 Gy，连续三天 抗PD-1药物：camrelizumab（江苏恒瑞），每三天尾静脉注射一次 si-Hspb1：慢病毒介导的si-Hspb1尾静脉注射 细胞处理：RT+anti-PD-1或/和Alkbh5-OE 动物分组：每组n=5或n=6
摘要
放疗（RT）与抗PD-1免疫治疗（IO）的联合在治疗肝细胞癌（HCC）中显示出显著疗效。然而，其潜在机制尚不完全清楚。建立Hepa1-6小鼠HCC模型以探索联合治疗在HCC中的抗肿瘤机制。值得注意的是，联合治疗有效抑制了携带Hepa1-6肿瘤的小鼠的肿瘤生长。通过MeRIP测序，我们发现联合治疗增加了小鼠肿瘤中Hspb1（一种铁死亡负调控因子）的m6A修饰，并降低了其mRNA表达。联合治疗和Hspb1下调均显著诱导Hepa1-6细胞铁死亡。代谢组学分析显示，Hspb1下调进一步促进了Hepa1-6荷瘤小鼠的异常脂质代谢，增强了联合治疗的促铁死亡作用。同时，Hspb1下调进一步增强了荷瘤小鼠中RT和IO诱导的抗肿瘤免疫反应，表现为细胞毒性CD8+ T细胞数量显著升高。此外，联合治疗还显著下调了荷瘤小鼠中的RNA去甲基化酶Alkbh5。Alkbh5过表达增加了Hspb1表达并抑制了铁死亡，表明Alkbh5通过靶向Hspb1调控铁死亡。靶向Alkbh5/Hspb1/铁死亡轴可能增强联合治疗的抗肿瘤效果，突出了HCC的潜在治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 放疗联合抗PD-1免疫治疗在肝细胞癌中的抗肿瘤作用及潜在机制是什么？
- 核心机制
- 联合治疗通过下调RNA去甲基化酶Alkbh5，减少Hspb1 mRNA的m6A去甲基化，从而降低Hspb1表达，促进铁死亡。
- 主要证据
- MeRIP-seq和MeRIP-qPCR显示Hspb1 m6A修饰增加、mRNA水平降低；体外实验显示Hspb1下调诱导铁死亡，Alkbh5过表达逆转此效应；体内实验显示联合治疗促进肿瘤铁死亡并增强CD8+ T细胞免疫。
- 研究意义
- 靶向Alkbh5/Hspb1/铁死亡轴可能增强联合治疗的抗肿瘤效果，为HCC提供潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
MeRIP-seq筛选m6A修饰差异基因
探索联合治疗调控的m6A修饰靶点
对对照组和联合治疗组肿瘤组织进行MeRIP-seq，鉴定差异m6A峰和差异表达基因，并进行GO和KEGG富集分析。
体外验证Hspb1对Hepa1-6细胞功能的影响
验证Hspb1对细胞增殖、迁移和凋亡的作用
通过si-Hspb1或Hspb1-OE转染Hepa1-6细胞，进行克隆形成、流式凋亡和伤口愈合实验。
体外验证Hspb1对铁死亡的影响
验证Hspb1是否调控Hepa1-6细胞铁死亡
转染si-Hspb1或Hspb1-OE后，通过TEM观察线粒体形态，检测ROS、Fe2+水平以及铁死亡相关蛋白表达。
验证联合治疗通过Alkbh5/Hspb1轴促进铁死亡
验证联合治疗是否通过Alkbh5/Hspb1轴诱导铁死亡
用RT+anti-PD-1处理Hepa1-6细胞，并联合Alkbh5-OE，检测铁死亡标志物和蛋白表达。
体内验证联合治疗对铁死亡的影响
验证联合治疗在体内是否促进肿瘤铁死亡
对荷瘤小鼠进行RT+anti-PD-1治疗，检测肿瘤组织铁死亡相关形态和蛋白表达。
评估si-Hspb1联合治疗对T细胞免疫的影响
验证Hspb1下调是否增强抗肿瘤免疫
通过流式细胞术分析外周血中CD8+ T细胞、IFN-γ+ CD8+ T细胞及效应记忆T细胞的比例。
代谢组学分析脂质代谢变化
验证铁死亡相关的脂质代谢异常
对对照组、RT+anti-PD-1组和RT+anti-PD-1+si-Hspb1组血清样本进行非靶向代谢组学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 卡瑞利珠单抗 | Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., LTD | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Lipo2000转染试剂 | -- | -- |
| 细胞凋亡检测 | Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒 | -- | -- |
| ROS检测 | ROS检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng | E004-1-1 |
| 铁含量检测 | 亚铁比色法检测试剂盒 | Elabscience | E-BC-K773-M |
| Western blot | 抗Alkbh5抗体 | Proteintech | 67811-1-Ig |
| 抗Hspb1抗体 | Proteintech | 18284-1-AP | |
| 抗Tfr1抗体 | Proteintech | 10084-2-AP | |
| 抗Pcbp1抗体 | Abcam | ab168378 | |
| 抗Gpx4抗体 | Proteintech | 30388-1-AP | |
| 抗Slc7a11抗体 | Proteintech | 26864-1-AP | |
| 抗Acsl4抗体 | Proteintech | 22401-1-AP | |
| 抗Gapdh抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗β-actin抗体 | Abcam | ab8227 | |
| RT-qPCR | Redzol试剂 | SBS Genetech Co., Ltd | -- |
| SureScript™第一链cDNA合成试剂盒 | GeneCopeia | -- | |
| 2×SYBR Green qPCR预混液（无ROX）试剂盒 | Servicebio | -- | |
| TUNEL染色 | TUNEL细胞凋亡检测试剂盒 | BOSTER | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | BALB/c小鼠（雄性，20±2g，6周龄）；Hepa1-6细胞注射数量1×10^6；RT剂量8 Gy连续三天；抗PD-1给药方式尾静脉注射每三天一次；si-Hspb1给药方式尾静脉注射慢病毒；每组样本量n=5或n=6 阅读提示：Materials and methods - Animal study |
| 细胞培养与转染 | Hepa1-6细胞来源Procell；DMEM含10% FBS；转染试剂Lipo2000；Alkbh5-OE和si-Hspb1由HANBIO构建 阅读提示：Materials and methods - Cell culture and transfection |
| 体外铁死亡检测 | ROS检测使用DCFH-DA探针孵育30 min；Fe2+检测使用Ferrous Iron Colorimetric Assay Kit；TEM观察线粒体形态 阅读提示：Materials and methods - Transmission electron microscopy, Detection of reactive oxygen species, Measurement of iron content |
| MeRIP-seq | 测序平台Illumina NovaSeq 6000；差异m6A峰筛选阈值|log2FoldChange|≥1且P<0.05；MeTDiff软件 阅读提示：Materials and methods - Methylated RNA immunoprecipitation sequencing |
| 流式细胞术 | 外周血单细胞悬液制备；抗体CD45, CD3, CD4, CD8a, CD44, CD62L, IFN-γ；孵育条件4°C 1 h避光 阅读提示：Materials and methods - Flow cytometry assay |