AjCTP1/2和受体的克隆与系统发育分析
鉴定并确认海参中CT型神经肽前体及其候选受体的序列与进化关系。
通过RACE克隆获得AjCTP1、AjCTP2、AjCTR、AjPDFR1、AjPDFR2的cDNA序列，并进行序列比对、结构域预测、磷酸化位点预测和系统发育树构建，以及基因共线性分析。
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后口动物中作为降钙素型和色素分散因子型受体配体的神经肽的功能表征
Functional characterization of neuropeptides that act as ligands for both calcitonin-type and pigment-dispersing factor-type receptors in a deuterostome.
实验完整度
高包括受体药理学实验（CRE/SRE/luciferase、cAMP检测、受体内化、Western blot）、体外肌肉/肠道松弛实验、体内药理注射与RNAi敲低实验，以及qRT-PCR和免疫组化等多层级验证。
主要模型
HEK293T细胞（异源表达受体） 仿刺参纵肌制备物 仿刺参肠道制备物 仿刺参（成体与幼体）
重点核对
AjCT1和AjCT2（10^-6 M）在HEK293T细胞中激活AjCTR、AjPDFR1、AjPDFR2的CRE和SRE报告基因活性，且AjCT2对SRE活性的激活在AjPDFR2中仅AjCT2有效。 cAMP积累实验证实AjCT1和AjCT2（10^-9–10^-5 M）以剂量依赖方式激活三种受体，且AjCTR介导的cAMP最大值高于AjPDFR1和AjPDFR2。 在体药理实验中，AjCT1/AjCT2注射浓度分别为5×10^-3 mg/mL（低剂量）和5×10^-1 mg/mL（高剂量），注射体积为1 μL/g湿重，实验持续24天。 肌条实验中，AjCT1和AjCT2引起纵肌剂量依赖性松弛（10^-10–10^-6 M），AjCT2引起肠道松弛（10^-9–10^-5 M），而AjCT1对肠道无作用。 RNAi敲低：siAjCTP1/2-1和siAjPDFR2-1显著降低WGR和SGR，并影响生长因子基因表达（如AjGDF-8上调、AjMegf6下调）。
摘要
降钙素（CT）相关肽家族通过两种G蛋白偶联受体CTR和CTR样受体CLR在哺乳动物中发挥多种生理效应。CT型信号的系统发育分析揭示了在后口动物和原口动物无脊椎动物中都存在CT型肽和CTR/CLR型蛋白。此外，实验研究表明，在原口动物黑腹果蝇中，CT样肽DH31可作为CTR/CLR型受体和色素分散因子（PDF）受体的配体。在此，我们研究了后口动物无脊椎动物——海参（棘皮动物门）中的CT型神经肽的信号机制和功能。在海参中，一个基因编码两种CT型肽（AjCT1和AjCT2），这两种肽均可作为CTR/CLR型受体（AjCTR）和两种PDF型受体（AjPDFR1、AjPDFR2）的配体，但下游cAMP/PKA、Gαq/Ca2+/PKC和ERK1/2信号通路的激活存在差异。编码AjCT1/AjCT2的转录本在中枢神经系统和多种器官系统中检测到，并使用海星CT型肽（ArCT）的抗血清通过免疫组化可视化了神经肽的表达。体外药理学实验表明，AjCT1和/或AjCT2引起纵肌和肠道制备物的剂量依赖性松弛。此外，体内药理学实验结合功能获得和功能丧失实验揭示了AjCT2/AjPDFR2信号在促进海参摄食和生长中的潜在生理作用。据我们所知，这是第一项获得证据表明CT型肽可以作为后口动物中CTR/CLR型和PDF型受体的配体的研究。此外，它首次提供了CT型神经肽在两侧对称动物中具有食欲刺激和促进生长作用的证据。鉴于海参作为食物的经济重要性，发现CT型肽作为该物种摄食和生长的潜在调节因子可能为水产养殖应用提供新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 海参中的CT型神经肽AjCT1和AjCT2是否可作为AjCTR、AjPDFR1和AjPDFR2的配体，并发挥何种生理功能？
- 核心机制
- AjCT1/AjCT2通过激活CTR/CLR型和PDF型受体（除AjCT1/AjPDFR2仅激活cAMP/PKA通路外，其余组合均激活cAMP/PKA和Gαq/Ca2+/PKC通路，并偶联ERK1/2），其中AjCT2通过AjPDFR2介导的信号通路促进摄食和生长。
- 主要证据
- 异源表达细胞中的荧光素酶报告基因、cAMP积累、受体内化和Western blot实验证明配体-受体激活及信号通路差异；qRT-PCR显示AjCTP1/2在神经系统高表达；AjCT2在体内促进摄食和生长，且AjCTP/PDFR2敲低引起生长抑制。
- 研究意义
- 该研究首次表明CT型肽可作为后口动物中CTR/CLR型和PDF型受体的配体，并首次报道CT型神经肽在两侧对称动物中具有促摄食和促生长的作用，为海参水产养殖应用提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
配体-受体激活及信号通路检测
验证AjCT1和AjCT2是否能激活三种候选受体并检测下游信号通路。
在HEK293T细胞中分别转染AjCTR、AjPDFR1、AjPDFR2，使用CRE-Luc和SRE-Luc报告基因检测cAMP和Ca2+信号，ELISA检测cAMP积累，观察受体内化，并用Western blot检测ERK1/2磷酸化。
基因表达和组织分布分析
检测AjCTP1/2和受体基因在不同组织中的表达水平，并通过免疫组化定位神经肽。
利用qRT-PCR检测五种组织中的转录本表达，利用ArCT抗血清进行免疫组化染色。
体外药理活性检测
检测AjCT1和AjCT2对纵肌和肠道制备物的松弛作用。
分离纵肌和肠道制备物，以乙酰胆碱（ACh）诱导收缩后，累积添加AjCT1或AjCT2并记录松弛反应。
体内药理实验
评估长期注射AjCT1和AjCT2对海参摄食和生长的影响。
将150只海参随机分为五组（CT1L、CT1H、CT2L、CT2H、CO），隔日注射肽或无菌海水，持续24天，记录体重、残饵和粪便量，并检测肠道生长因子基因表达。
RNAi敲低实验
通过敲低AjCTP1/2或AjPDFR2验证其在摄食和生长调控中的作用。
设计siRNA并注射海参，检测干扰效率，然后进行长期敲低实验，测量体重、残饵、粪便及生长因子基因表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
序列与系统发育分析
评估体外药理活性
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 受体克隆与质粒构建 | SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 | Takara | 634858 |
| 细胞培养 | HEK293T细胞 | Procell | CL-0005 |
| 质粒构建 | pcDNA 3.1(+)载体 | YouBio | VT1001 |
| pEGFP-N1载体 | YouBio | VT1110 | |
| Western blot | 抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG抗体 | Absin | abs20040 | |
| 免疫组化 | ArCT抗血清 | -- | RRID:AB_2721239 |
| 过氧化物酶标记的亲和纯化山羊抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 配体合成 | AjCT1神经肽 | Sangon biotech | -- |
| AjCT2神经肽 | Sangon biotech | -- | |
| 信号通路抑制 | FR900359 | Cayman Chemical | 107530-18-7 |
| Gö 6983 | Cayman Chemical | 133053-19-7 | |
| H89 | Absin | 130964-39-5 | |
| cDNA合成 | Hifair III第一链cDNA合成预混液 | YEASEN | 11141ES60 |
| qRT-PCR | Hieff UNICON通用蓝qPCR SYBR Green预混液 | YEASEN | 11184ES08 |
| 报告基因检测 | 萤火虫荧光素酶报告基因检测试剂盒 | MK | MF4001 |
| cAMP检测 | cAMP检测试剂盒 | R&D systems | KGE002B |
| RNA提取 | Trizol RNA提取试剂 | Vazyme | -- |
| RNAi | Lipo6000转染试剂 | Beyotime | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 受体激活与信号通路检测 | HEK293T细胞系、转染质粒（pcDNA3.1+或pEGFP-N1）、肽浓度（10^-6 M）、抑制剂浓度（H89 10 μM、FR900359 1 μM、Gö 6983 1 μM）、cAMP检测浓度范围（10^-9–10^-5 M）、孵育时间（报告基因4小时，cAMP 15分钟，ERK 5分钟） 阅读提示：Materials and methods - 'Testing AjCT1 and AjCT2 as ligands for candidate receptors...' |
| 体外肌肉松弛实验 | 纵肌和肠道制备物长度（20 mm）、浴槽体积（20 mL）、静息张力（1.0 g）、ACh浓度（纵肌10^-6 M，肠道10^-5 M）、AjCT1/AjCT2浓度梯度、实验重复次数 阅读提示：Materials and methods - 'Analysis of the in vitro activity of AjCT1 and AjCT2...' |
| 体内药理实验 | 动物数量（每组30只）、分组（CT1L/CT1H/CT2L/CT2H/CO）、注射剂量（5×10^-3或5×10^-1 mg/mL，1 μL/g湿重）、注射频率（隔日）、实验时长（24天）、WGR和SGR计算公式 阅读提示：Materials and methods - 'Investigation of the in vivo pharmacological effects...' |
| RNAi敲低实验 | siRNA序列、siRNA浓度（20 μM）、转染试剂体积（20 μL Lipo6000）、注射剂量（1 μL/g湿重）、注射频率（每日）、敲低效率验证方法、实验时长（24天） 阅读提示：Materials and methods - 'Loss-of-function experiments by RNA interference (RNAi)' |
| 基因表达分析 | qRT-PCR内参基因（β-actin和β-tubulin）、分析方法（2^-ΔΔCT）、样本量（n=5或6）、免疫组化抗血清稀释度（1:2000-1:4000）、染色条件 阅读提示：Materials and methods - 'Total RNA extraction and quantitative real-time PCR (qRT-PCR) detection'和'Localization of CT-type neuropeptide expression...' |