成纤维细胞分离与鉴定
从肝癌组织和癌旁组织分离CAFs和PAFs，并验证其成纤维细胞特性。
收集肝癌及癌旁组织，消化后离心分离成纤维细胞，培养用于后续实验。通过显微镜观察形态，Western blot检测标志物（Vimentin、α-SMA、FAP、CK19、E-cadherin）。
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肿瘤成纤维细胞中CAFs来源的SPI1通过调控HRAS和PD-L1转录促进肝癌细胞的恶性行为和免疫逃逸
CAFs-derived SPI1 in tumor fibroblasts promotes malignant behaviors of liver cancer cells and immune escape by regulating HRAS and PD-L1 transcription.
实验完整度
高包含体外细胞模型（Huh7、Hep3B）、原代成纤维细胞分离培养、功能验证（增殖、迁移、侵袭、糖酵解、免疫逃逸）及机制验证（ChIP、双荧光素酶报告基因），多层级证据。
主要模型
肝癌细胞系Huh7 肝癌细胞系Hep3B 原代培养的CAFs和PAFs CD8+T细胞共培养体系
重点核对
CAFs和PAFs的分离与鉴定（形态、标志物表达） 缺氧处理CAFs（94% N2, 5% CO2, 1% O2培养48小时） sh-SPI1敲低和pcDNA-HRAS过表达效率 CAFs条件培养基（CAFs-CM）的收集方法（无血清培养24小时） CD8+T细胞共培养的比率和条件
摘要
背景：作为全球第五大常见癌症，肝细胞癌（HCC）是一种高度恶性、预后极差的疾病。在肿瘤微环境中，癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过为癌细胞提供支持性环境，在肿瘤发生和进展中发挥重要作用。本研究旨在阐明CAFs和沙门氏菌致病岛1（SPI1）在HCC进展中的调控机制。方法：分别采用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测蛋白质和mRNA表达水平。使用葡萄糖消耗和乳酸生成检测试剂盒检测糖酵解能力。采用集落形成实验检测细胞增殖。分别采用划痕愈合和Transwell实验评估细胞迁移和侵袭。通过流式细胞术和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记（TUNEL）检测细胞凋亡。结果：成功分离了CAFs和癌旁成纤维细胞（PAFs）。缺氧应激下的CAFs（H/CAFs）促进HCC细胞（Huh7和Hep3B）的葡萄糖消耗和乳酸生成。CAFs条件培养基（CAFs-CM）促进HCC细胞增殖、迁移、侵袭、葡萄糖消耗和乳酸生成。CAFs-CM促进程序性细胞死亡配体1（PD-L1）表达和CD8+T凋亡，并阻碍CD8+T增殖。SPI1被鉴定为CAFs差异表达基因（DEGs）（GSE192912）和转录因子（TF）的共同靶标。SPI1的mRNA和蛋白表达在CAFs中升高。在CAFs-CM培养的HCC细胞中，敲低SPI1抑制了PD-L1表达水平、葡萄糖消耗、乳酸生成、增殖、侵袭和免疫逃逸。结论：CAFs来源的SPI1通过上调v-Ha-ras Harvey大鼠肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）表达促进HCC细胞的恶性行为。本研究丰富了我们对HCC在分子水平的理解，并可能为开发HCC治疗新策略铺平道路。补充信息：在线版本包含补充材料，可在10.1186/s41065-025-00605-2获取。关键词：肝细胞癌、CAFs、SPI1、免疫逃逸、HRAS/PD-L1信号通路。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CAFs来源的SPI1在肝癌进展和免疫逃逸中的作用及分子机制是什么？
- 核心机制
- CAFs来源的SPI1通过转录激活HRAS表达，进而上调PD-L1水平，促进肝癌细胞的恶性行为（增殖、迁移、侵袭、糖酵解）和免疫逃逸（抑制CD8+T增殖、促进CD8+T凋亡）。
- 主要证据
- 利用GSE192912数据及转录因子分析筛选出SPI1，qRT-PCR和Western blot验证其在CAFs中高表达；功能实验表明sh-SPI1抑制CAFs-CM诱导的恶性行为；ChIP和双荧光素酶报告实验证明SPI1结合HRAS启动子。
- 研究意义
- 丰富了HCC在分子水平的理解，可能为HCC治疗提供新的生物标志物或靶点，并提示新的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
缺氧诱导CAFs
模拟肿瘤微环境缺氧条件，观察CAFs糖酵解表型变化。
CAFs在缺氧条件下（94% N2、5% CO2、1% O2）培养48小时，命名为H/CAFs；对照为常氧条件（N/CAFs）。检测葡萄糖消耗和乳酸生成。
CAFs-CM对肝癌细胞功能的影响
评估CAFs分泌因子对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和糖酵解的影响。
收集CAFs或PAFs条件培养基（CAFs-CM/PAFs-CM），处理Huh7和Hep3B细胞后，通过集落形成、划痕愈合、Transwell、葡萄糖消耗和乳酸生成检测评估功能变化。
免疫逃逸检测
评估CAFs-CM对PD-L1表达及CD8+T细胞凋亡和增殖的影响。
CAFs-CM处理肝癌细胞后，检测PD-L1表达（Western blot、流式）、共培养CD8+T后检测肝癌细胞凋亡（流式）、CD8+T增殖（免疫荧光Ki-67）和凋亡（TUNEL）。
SPI1敲低对肝癌细胞功能的影响
验证SPI1是否介导CAFs-CM对肝癌细胞恶性行为和免疫逃逸的促进作用。
用sh-SPI1转染CAFs，收集条件培养基（CAFs/sh-SPI1-CM），处理Huh7和Hep3B细胞，检测SPI1表达、糖酵解、增殖、迁移、侵袭、PD-L1表达、共培养后细胞凋亡和CD8+T功能。
SPI1调控HRAS的机制验证
阐明SPI1是否通过结合HRAS启动子促进其转录。
通过生物信息学预测（GEPIA、JASPAR）、qRT-PCR和Western blot检测HRAS表达，ChIP和双荧光素酶报告基因验证SPI1与HRAS启动子的结合。
HRAS回补实验
验证HRAS是否是SPI1下游关键效应分子。
在CAFs/sh-SPI1-CM处理的肝癌细胞中过表达HRAS（pcDNA-HRAS），检测糖酵解、增殖、迁移、侵袭、PD-L1表达及免疫逃逸指标是否恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 成纤维细胞分离和培养 | DMEM培养基 | BersinBio | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 成纤维细胞分离 | 透明质酸酶 | Beyotime | -- |
| I型胶原酶 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | BersinBio | -- |
| CD8+T细胞分离 | CD8+T细胞分选试剂盒 | STEMERY | -- |
| 细胞转染 | Lipomaster 3000转染试剂 | Vazyme | -- |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Biosharp | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Vazyme | -- |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | Proteintech | 20874-1-AP | |
| 抗CK19抗体 | Proteintech | 10712-1-AP | |
| 抗α-SMA抗体 | Proteintech | 14395-1-AP | |
| 抗波形蛋白抗体 | Proteintech | 80232-1-AP | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab179467 | |
| 抗PD-L1抗体 | Proteintech | 66248-1-Ig | |
| 抗SPI1抗体 | Proteintech | 55100-1-AP | |
| 抗HRAS抗体 | Proteintech | 18295-1-AP | |
| 二抗 | Proteintech | -- | |
| Tanon 1600系列多功能凝胶图像分析系统 | Tanon | -- | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Solarbio | -- |
| NanoDrop2000c分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PrimeScript™ RT试剂盒 | Takara | -- | |
| 7300实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 葡萄糖消耗检测 | 葡萄糖摄取检测试剂盒 | Abcam | -- |
| 乳酸生成检测 | 乳酸检测试剂盒 | Dongjingdo | -- |
| 酶标仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 集落形成实验 | 结晶紫溶液 | Biosharp | -- |
| 甲醇 | -- | -- | |
| 划痕愈合 | Image J软件 | National Institutes of Health | -- |
| Transwell | 基质胶 | Beyotime | -- |
| Transwell小室 | Corning | -- | |
| 流式细胞术 | PD-L1抗体 (ab205921) | Abcam | ab205921 |
| 流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 细胞凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| CD8+T增殖检测 | 抗Ki-67抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5698-82 |
| DAPI核染料 | Biosharp | -- | |
| TUNEL | TUNEL BrightGreen凋亡检测试剂盒 | Vazyme | -- |
| ChIP | ChIP检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 抗SPI1抗体 (ab302623) | Abcam | ab302623 | |
| IgG抗体 | Abcam | -- | |
| Dynabeads蛋白G磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | PGL3载体 | GenePharma | -- |
| 定点突变试剂盒 | Stratagene | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega Corporation | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism 8软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 成纤维细胞分离与培养 | 组织来源、消化酶浓度、离心速度和时间、培养基成分、培养代数、缺氧处理条件 阅读提示：Materials and methods: Isolation, culture, and treatment of fibroblasts; Fig. 1 |
| 条件培养基收集 | 细胞密度、洗涤次数、无血清培养基类型、孵育时间、储存温度 阅读提示：Materials and methods: Collection of cell culture medium |
| 细胞功能实验 | 处理时间、细胞密度、染色浓度和时间、检测方法 阅读提示：Materials and methods: Colony formation assay, Wound healing, Transwell; Figure legends |
| SPI1敲低与HRAS过表达 | shRNA序列、质粒、转染试剂、转染时间、敲低或过表达效率验证 阅读提示：Materials and methods: Cell transfection; Figure legends |
| 免疫共培养实验 | CD8+T细胞分离效率、共培养比例、处理时间、检测指标 阅读提示：Materials and methods: CD8+T separation, CD8+T proliferation assay, TUNEL; Figure legends |
| 机制验证 | ChIP抗体、PCR引物、报告基因载体、突变位点、转染条件 阅读提示：Materials and methods: ChIP assay, Dual-luciferase reporter assay; Figure 5 |